范力文 趙珩

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·綜 述·

表皮生長因子受體檢測在早期非小細胞肺癌診治中的研究進展

范力文 趙珩

一、引言

據(jù)報道，肺癌是目前最常見癌癥之一，2015年美國數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示肺癌在惡性腫瘤中發(fā)病率第二，死亡率第一(25%-30%)[1]，在我國也占據(jù)惡性腫瘤死亡率首位；其中80%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[2]，ⅢA期患者中位5年生存率僅為26%左右，IA期患者則是51%。由于肺癌發(fā)病隱匿，早期常無特異性臨床表現(xiàn)，60%以上患者在確診時已處于晚期，失去最佳手術機會，是導致肺癌病死率較高的主要原因[1, 3]。而早期診斷的患者經(jīng)過合理的選擇性個體化治療可以將生存率提高到70%，所以肺癌早期篩查顯得尤為重要。肺癌作為實體腫瘤，其發(fā)生發(fā)展與轉移依賴于新生血管形成，而表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在誘導新生血管形成過程中扮演重要角色，與肺癌疾病機制關系密切[2,4-5]。

研究顯示，EGFR是一種存在于細胞膜表面的糖蛋白受體，是ErbB 酪氨酸激酶受體家族的成員，在80%-85% 的NSCLC 中表達，其不僅存在于細胞膜表面，在細胞核內也發(fā)現(xiàn)有高表達。EGFR家族及配體與NSCLC 的發(fā)生發(fā)展、惡性程度關系密切。EGFR同型或異型二聚體與配體結合，激活酪氨酸激酶活性導致受體細胞質部分自動磷酸化，從而激活下游MPAK、PI3K/AKT及JAK/STAT等信號通路，導致腫瘤細胞增殖、抗凋亡、侵襲、遠處轉移及新生血管形成[4-5]。

在NSCLC中EGFR突變一般是指EGFR激酶結構域具有敏感性突變，表現(xiàn)為在外顯子19位點缺失或21位點L858R處發(fā)生替換。這些基因突變使得EGFR激酶結構域處于持續(xù)激活狀態(tài)，導致活化增殖信號經(jīng)由PI3K-Akt-mTOR和Ras-Raf-MEK通路下傳[5-6]。

目前EGFR組織學/細胞學檢測仍然是EGFR基因突變檢測的金標準，具有很高的敏感性與特異性，EGFR血漿游離DNA檢測具有高度特異性，可以作為無法獲取組織或細胞學標本時的有效補充及替代方法。應用高通量測序等新技術(蝎形擴增阻滯突變系統(tǒng)法、變性高效液相色譜法、高分辨熔解曲線分析技術)檢測EGFR突變具有90%左右的敏感性，而特異性可達100%，使得假陰性率與假陽性率很低。數(shù)字聚合酶鏈式反應技術(PCR)檢測血漿游離DNA(cfDNA)中EGFR突變敏感性可達79%，特異性則為100%[7]。韓寶惠等[8]進行的IGNITE研究比較了組織學/細胞學標本與血漿游離DNA標本的EGFR基因突變檢測率，結果提示，在真實世界中，血液檢測與組織學/細胞學檢測的EGFR 突變吻合率為81%，血液檢測較組織學/細胞學檢測具有較高的特異性，在亞太地區(qū)患者中達到97.2%，血液檢測EGFR基因突變的敏感性為49.6%，較以往IFUM(65.7%)等臨床研究的結果偏低，可能是由于腫瘤分期、血液標本的處理、EGFR檢測方法等方面的差異造成的。Chai X等[9]使用循環(huán)單分子擴增與再測序技術(cSMART)檢測血漿EGFR突變敏感性較高，為72%。因此，血液檢測的假陽性率低，在臨床檢測中發(fā)現(xiàn)血液EGFR基因突變陽性的患者，可以認為是真正的EGFR突變陽性患者；對于EGFR血液標本檢測陰性患者的解讀應持謹慎的態(tài)度，特別是對于EGFR突變的優(yōu)勢人群(如腺癌、女性、非吸煙患者)，應設法獲取組織標本檢測，或重復進行多次血液學檢測以明確突變狀態(tài)[10]。

二、研究進展

1. 早期診斷

(1) EGFR高表達

研究表明，早期NSCLC腫瘤組織及淋巴組織中存在EGFR高表達。Zhuo Y等[11]采用定量實時聚合酶鏈式反應技術(RT-PCR)檢測結果表示EGFR mRNA在早期NSCLC患者腫瘤組織和淋巴組織中表達水平高于良性肺病對照組(P<0.05)，并且具有明顯相關性(r=0.904，P<0.001)；Brabender等[12]研究發(fā)現(xiàn)83例早期NSCLC患者中33.7%存在EGFR mRNA高表達；Yasuda H等[13]研究發(fā)現(xiàn)通過氣管鏡取得肺上皮細胞表面分泌液檢測EGFR比使用血漿標本敏感性顯著提高(58.3%vs8.3%)；Hirsch FR等[14]研究顯示183例Ⅰ-Ⅲ期NSCLC患者腫瘤組織中62%存在EGFR蛋白高表達，基因拷貝數(shù)與蛋白表達相關(r=0.4，P<0.001)。

此外，EGFR在血清水平存在高表達。王勇等[15]研究表明NSCLC患者術前血清中EGFR含量高于良性肺病患者和健康人(P<0.05)，有吸煙史(>400支/年)、較高的TNM分期及淋巴結轉移是術前血清EGFR升高的危險因素；Miura N等[16]研究顯示肺癌患者血清中EGFR mRNA表達明顯高于肺良性疾病患者(P<0.01)，同時與腫瘤組織中所表達EGFR mRNA顯著相關(P<0.01)，其表達與腫瘤數(shù)量、遠處轉移、復發(fā)、臨床分期顯著相關(P<0.05)，其用于肺癌診斷的特異性和敏感性分別為80.0%和71.3%；Zhang等[17]采用RT-PCR檢測EGFR mRNA在NSCLC患者外周血中陽性率與良性肺部疾病患者相比具有統(tǒng)計學差異，分別是69.0%和12.5%(P<0.05)，可用于判斷腫瘤細胞微轉移及患者預后；宋萍等[18]研究顯示NSCLC患者外周血EGFR mRNA表達明顯高于肺良性疾病患者(P<0.05)，并且表達水平與臨床分期呈正相關；Zhuo Y等[11]研究同樣顯示NSCLC患者血漿中EGFR表達水平與腫瘤及淋巴結組織中EGFR表達水平具有顯著相關性(r = 0.616，P<0.001；r = 0.764，P<0.001)。由此，檢測EGFR在早期NSCLC患者血液中的水平為早期診斷提供了臨床依據(jù)。

(2) EGFR基因突變

腫瘤發(fā)生發(fā)展是多因素參與的過程，其中驅動基因(driver gene)發(fā)揮了重要作用，所以在檢測驅動基因的同時配套檢測一系列相關基因(passenger gene)，可提高早期肺癌患者EGFR檢測的敏感性。劉淼等[19]研究表明NSCLC中HER2、c-jun、c-fos、p21的表達與EGFR異常擴增呈正相關，在EGFR介導的信號傳導通路中發(fā)揮了正性調節(jié)作用；Massarelli、Douillard等[20-21]研究發(fā)現(xiàn)KRAS基因在EGFR傳導通路中起重要作用，KRAS突變導致EGFR-TKI耐藥；Kris等[22]研究表明1000名肺癌患者樣本中有60%發(fā)生至少一種基因突變，其中EGFR占23%，KRAS占25%。

2. 判斷預后

研究表明，EGFR表達與腫瘤微轉移及患者生存時間存在相關性。Zhuo等[11]研究結果表示在NSCLC患者中，腫瘤及淋巴結組織EGFR mRNA表達水平淋巴結轉移組明顯高于無淋巴結轉移組(P<0.05)；王勇等[15]研究表明術前EGFR高表達患者和術后EGFR仍處于高水平的患者生存時間顯著縮短(P<0.05)，術前高血清EGFR水平是影響患者生存時間的獨立危險因素，淋巴結轉移是影響患者術前血清EGFR升高的危險因素，表示對早期判斷是否發(fā)生淋巴結轉移具有一定價值；宋萍等[18]研究同樣表示NSCLC患者外周血中存在EGFR高表達，與腫瘤早期發(fā)生微轉移有關； Traynor等[23]研究顯示，早期NSCLC腫瘤組織中核EGFR(nuclear EGFR)蛋白表達與較晚的分期(Ⅰ期14.5%vsⅡ期45.5%，P=0.023)、較短的無進展生存期(progression-free survival，PFS)[中位PFS 8.7個月vs14.5個月，風險比(hazard ratio，HR)1.89，95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)=1.15-3.10，P=0.011]、較短的總生存期(overall survival，OS)(中位OS 14.1個月vs23.4個月，HR 1.83，95% CI=1.12-2.99，P=0.014)有關，可作為患者預后獨立預測因子；Izar B等[24]研究發(fā)現(xiàn)307例I期NSCLC患者中EGFR突變型與野生型相比具有較低腫瘤復發(fā)率(9.7%vs21.6%，P=0.03)、較長中位無病生存期(disease free survival，DFS)(8.8vs7.0年，P=0.0085)、較高5年生存率(98%vs73%，P=0.003)，是肺癌預后的獨立預測因子；Passlick等[25]研究表示在Ⅰ期NSCLC患者中，約20%-40%手術前在骨髓中檢測到癌細胞，并且此類患者術后預后較陰性者差，表明存在腫瘤微轉移。所以EGFR檢測用于判斷早期NSCLC患者預后情況具有一定可行性。

3. 早期治療

驅動基因的發(fā)現(xiàn)與靶向藥物治療在晚期NSCLC治療領域取得顯著成效，明顯改善了晚期NSCLC患者的預后及生存質量。其中表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)在晚期NSCLC治療中成為一線治療方案[26]，取得明顯成效，影像學反應率與PFS均是傳統(tǒng)化療的2-3倍，并且更容易讓患者接受；而在早期肺癌治療中的運用卻不甚明了[6]。

(1) 回顧性研究

Janjigian YY等[27]開展的多因素回顧性研究表示，在167例早期NSCLC患者中，EGFR 19/21位點突變陽性的患者手術切除腫瘤組織后接受厄洛替尼或吉非替尼輔助治療2年的DFS率為89%，未接受EGFR-TKI治療的對照組DFS率為72%[HR 0.53，95% CI=0.28-1.03，P=0.06]，接受EGFR-TKI治療的患者2年OS率為96%，對照組2年OS率為90%(HR 0.62，95% CI=0.28-1.03，P=0.296)，未達統(tǒng)計學差異，但可認為輔助治療有所獲益。

Lv等[28]開展的回顧性研究提示具有EGFR突變的早期NSCLC患者完全切除術后接受EGFR-TKI治療DFS有所獲益。138例EGFR突變患者中，31例接受EGFR-TKI治療，其DFS比接受傳統(tǒng)化療(P=0.038)或未接受其他治療(P=0.033)的患者更長。

(2) 前瞻性研究

Neal等[29]開展的SELECT多中心單臂二期臨床試驗表明36例EGFR突變陽性的早期NSCLC患者在手術及輔助放化療治療后接受厄洛替尼治療2年DFS率為95%，生存率>85%，此研究已進入第二階段：入組100例患者每日服用150mg厄洛替尼，中位隨訪時間3年，2年DFS率為90%，2年后停藥觀察到腫瘤復發(fā)率升高，停藥后的中位復發(fā)時間平均是8.5個月；試驗中40%患者服用藥物劑量減少到100mg，16%患者減少到50mg，69%的患者完成了至少22個月的療程。

Kelly等[30]開展的RADIANT多中心三期雙盲隨機臨床試驗中，亞組入組存在EGFR基因突變且完全切除腫瘤后伴或不伴輔助化療的161例早期NSCLC患者，按2 ∶1比例隨機分配接受厄洛替尼150mg或安慰劑治療2年，實驗組具有更長的DFS率(HR 0.61，95% CI=0.384-0.981，P=0.0391)；實驗組中位用藥時間12個月，安慰劑組則是22個月，皮疹與腹瀉在實驗組與安慰劑組中發(fā)生率分別是58%、52%對17%、16%。

Eric等[31]開展的前瞻性研究表明23例早期NSCLC患者接受4周吉非替尼250mg治療后行手術治療，所有患者未出現(xiàn)明顯毒副反應，其中22位患者擁有穩(wěn)定的狀態(tài)，影像學檢測結果無腫瘤進展，腫瘤組織中吉非替尼水平是外周血中吉非替尼水平的40倍，說明腫瘤組織富集吉非替尼。

Lara-Guerra[2]等進行的單臂臨床試驗表示，36位I期NSCLC患者術前每天接受吉非替尼250mg治療一個月，隨后接受手術治療，11%的患者獲得部分緩解(partial response，PR)，43%的患者腫瘤大小有所減退，腫瘤組織和血清檢測中EGFR蛋白表達率為83%，EGFR基因高拷貝率為59%，EGFR突變率為17%，中位隨訪時間2年后DFS率為78%，EGFR突變是治療反應最強的預測因子。

(3) 正在進行的研究

現(xiàn)有很多機構正在進行大樣本隨機臨床試驗如ALCHEMIST、Adjuvant Afatinib等，我國現(xiàn)有8項研究正在進行當中，其中有3項三期試驗受到國內外關注(NCT01405079、NCT01996098和NCT02125240)[3,6]。

ALCHEMIST試驗是由美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute)資助開展的目前最大的三期雙盲隨機臨床試驗，旨在探究基因組分析(包括克隆構型、克隆進化及耐藥機制)和分子靶向治療在早期NSCLC中的意義；計劃入組IB(腫瘤尺寸≥4cm)至ⅢA期完全切除術后并具有EGFR突變的NSCLC患者410例，完成標準輔助治療之后隨機分組接受150mg厄洛替尼或安慰劑治療2年。主要終點為OS，次要終點為2年DFS、不良事件發(fā)生率等。此研究是目前唯一的安慰劑對照試驗，同時會對8000例NSCLC患者進行系統(tǒng)性的基因組分析，探究更深層次的分子機制，意義重大備受關注[6, 32]。

ADJUVANT試驗(NCT01405079)是我國開展的三期隨機臨床試驗，為了探究EGFR-TKI與傳統(tǒng)化療藥物療效對比，入組Ⅱ-ⅢA(N1-N2)期完全切除并具有EGFR突變的NSCLC患者，隨機分組接受吉非替尼250mg/d治療2年或順鉑(75mg/m2，d1)與長春瑞濱(25mg/m2，d1/8)每3周共4療程。主要終點是3年DFS，次要終點是3年OS、3年和5年DFS率、5年OS率及不良事件等[3]。

以上研究雖未明確EGFR-TKI在早期NSCLC中應用的必要性，但可以看到治療有所獲益的趨勢(毒副反應小無死亡病例，不增加手術風險,口服用藥患者依從性高)，仍然具有重要參考價值。在2014年美國臨床腫瘤學會年會(ASCO)上研究學者們也對此問題進行了熱烈討論，為未來大樣本、多中心研究作出鋪墊[26, 33]。

三、總結與展望

由于多元基因組分析技術的發(fā)展，研究者對肺癌分子基礎與缺陷有了更深的認識，大量實驗室成果轉化為臨床應用，助力精準醫(yī)療。分子靶向治療、免疫治療等研究在晚期肺癌領域中取得顯著發(fā)展，與之相比早期肺癌在診斷及治療方面取得的進展，則十分有限。

上述研究表明，NSCLC腫瘤組織呈現(xiàn)EGFR高表達，為EGFR檢測用于肺癌早期診斷提供了參考依據(jù)。同時，EGFR在腫瘤組織與淋巴組織中表達具有相關性，說明用淋巴組織代替腫瘤組織進行EGFR檢測有一定可行性；此外，研究表明在NSCLC患者外周血中同樣存在EGFR高表達，行血清學檢測EGFR有助于肺癌的早期診斷。以上檢測方式具有創(chuàng)傷小、取樣方便等優(yōu)點，將其運用于臨床早期篩查肺癌的可行性較高。

分子生物學研究表明肺癌發(fā)生發(fā)展并不是單因素化，是通過不斷基因突變形成的一個多因素多階段共同作用的過程，這些變異基因往往集中于特定通路，因而這些通路(驅動基因)可成為重要生物標記，用來對肺癌進行早期診斷和對高危人群進行篩查。驅動基因EGFR在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中通過介導MAPK、PI3K、c-Src等通路進行調控。EGFR與其配體結合，激活RAS、c-jun、c-fos等下游調節(jié)因子，并與其它因子如VEGF產生協(xié)同作用，共同促進腫瘤細胞的增殖、轉移及新血管生成。因此，針對EGFR通路相關因素聯(lián)合多個生物標記甚至整個信號通路進行檢測，對NSCLC早期診斷具有重要意義，復合基因測序技術(multiplexed genotype testing)及下一代測序技術(next generation sequencing)的發(fā)展也為此提供了技術支持[5, 34]。

肺癌組織中EGFR表達水平、細胞核內EGFR表達水平、EGFR基因拷貝數(shù)及EGFR基因突變與患者預后關系緊密，影響患者生存時間，所以EGFR不僅為肺癌早期診斷提供參考，也可作為判斷患者預后情況的一項獨立指標。研究表明Ⅰ-Ⅲ期NSCLC手術后患者5年生存率約為50%-70%，多數(shù)患者死于腫瘤轉移及復發(fā)，即影像學未發(fā)現(xiàn)轉移的早期患者存在著腫瘤細胞微轉移，通過血液循環(huán)種植于其他臟器。循環(huán)血液中具有RNA裂解酶，會裂解游離的mRNA，若血液中檢測到一定水平mRNA則可反映其中存在完整腫瘤細胞。上述研究表示早期NSCLC患者術前外周血EGFR水平是淋巴結轉移的危險因素，對判斷早期腫瘤細胞微轉移具有一定價值；患者手術前與手術后血清EGFR水平與患者生存時間有密切聯(lián)系。所以綜合患者手術前后的血清EGFR水平變化，可作為評估患者預后情況的參考指標，為制定下一步治療計劃提供依據(jù)。如果患者完成所有標準治療后血清EGFR水平仍然較高，可以考慮進行輔助TKI治療。

各方研究報道傳統(tǒng)輔助化療將早期NSCLC患者5年生存率提高了5%-15%，是目前的標準治療方案[33]。然而此類患者腫瘤復發(fā)率仍然高達70%[35]，三分之一的Ⅰ期患者和30%-50%的Ⅱ、Ⅲ期患者死于腫瘤復發(fā)；同時化療藥物的副作用十分明顯，降低了患者依從性，所以十分有必要探尋新的治療方案來改善患者預后。EGFR檢測用于晚期NSCLC患者靶向治療已取得重大成效，研究人員希望其在早期NSCLC患者中同樣具有應用價值，能夠降低腫瘤復發(fā)率，延長患者遠期生存率。所以，以下兩個問題非常值得進一步探討：完成標準輔助化療的早期NSCLC患者是否應該加用輔助TKI治療？早期NSCLC患者完全切除后接受輔助TKI治療是否優(yōu)于輔助化療？

前述研究表明，EGFR突變陽性的早期NSCLC患者完全切除術后接受輔助EGFR-TKI治療有所獲益，2年DFS取得較大提高，復發(fā)率有所降低，但是總生存期沒有得到明顯提高[33]。EGFR-TKI藥物在輔助治療中的獲益機制現(xiàn)尚不清楚，藥物作用方式是細胞毒性方式或抑制細胞生長方式還有待進一步研究。如果TKI是通過細胞毒性方式發(fā)揮作用，那么延長用藥時間可能會取得更好的治療效果。但是，由SELECT與RADIANT研究可以看到厄洛替尼的副作用讓患者服用劑量有所下降，這對長期使用TKI藥物帶來了困難，可能會降低治療的療效。

目前已完成的研究存在樣本量小、單一中心、缺乏隨機對照等不足，從循證醫(yī)學角度來看證據(jù)等級不高。還需要進一步開展更多聚焦于EGFR突變的NSCLC隨機臨床試驗，以OS為主要終點，擴大樣本數(shù)量，多中心聯(lián)合取樣，延長觀察時間以獲得更加有力的證據(jù)。希望上述正在進行的臨床試驗能夠回答以上兩個問題，尤其是ALCHEMIST研究，以期將EGFR-TKI運用到早期肺癌臨床工作之中。另外，多個生物標志物的發(fā)現(xiàn)及EGFR信號通路的研究提供了一種思路，即在實行治療前對患者EGFR與其信號通路上具有協(xié)同作用的相關基因進行檢測，實現(xiàn)對患者個人的多靶點、個體化治療，達到精準醫(yī)療的目的[36]。

EGFR相關檢測實際應用于早期肺癌臨床診治工作中仍然存在很多問題，實現(xiàn)精準醫(yī)療仍面臨巨大挑戰(zhàn)。例如，如何制定檢驗EGFR的實驗室標準，如何選用生物標志對肺癌患者預后情況進行量化，藥物使用多少劑量，藥物使用多少時間，基因檢測費用問題等等，這為未來的研究提供了思路與方向。相信隨著對腫瘤復發(fā)機制的理解與基因檢測技術的不斷發(fā)展，早期肺癌患者的預后會越來越好。

綜上所述，EGFR檢測對于早期NSCLC的診斷、評估療效判斷患者預后情況及早期治療具有重要意義，有助于實現(xiàn)對早期NSCLC患者進行精準醫(yī)療，降低肺癌的高死亡率，是未來研究的熱門方向。

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10.3969/j.issn.1009-6663.2017.02.039

國家自然科學基金項目(No 81572693)；上海交通大學醫(yī)工交叉基金項目(No YG2015ZD14)

200030 上海，上海交通大學附屬胸科醫(yī)院胸外科

趙珩，E-mail:h_zhao28@163.com

2016-06-25]