羅勇 潘俊 程意 韓鋒鋒

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慢性阻塞性肺疾病大鼠模型骨骼肌組織氧化應(yīng)激損傷的研究

羅勇1，2潘俊2程意2韓鋒鋒2

目的 研究不同煙熏強(qiáng)度對SD大鼠骨骼肌組織氧化應(yīng)激損傷，探討慢性阻塞性肺疾病骨骼肌功能障礙的機(jī)制。方法 40只SD大鼠隨機(jī)分為對照組、實驗1組、實驗2組、實驗3組，每組各10只。實驗1組、實驗2組、實驗3組分別給予4周、12周、20周的煙熏制作慢性阻塞性肺疾病動物模型，煙熏結(jié)束后肺組織制作病理標(biāo)本觀察其變化，并取大鼠雙側(cè)伸趾長肌，用ELISA方法檢測各組大鼠的伸趾長肌組織勻漿丙二醛(MDA)的濃度、伸趾長肌組織蛋白質(zhì)提取液羰基化蛋白(PC)的濃度、伸趾長肌組織DNA中8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的含量。 結(jié)果 光鏡下大鼠肺組織隨著煙熏強(qiáng)度的增加，其肺組織炎性細(xì)胞浸潤、肺泡壁破壞相應(yīng)更為顯著。與對照組相比，實驗2組、實驗3組MDA、8-OHdG顯著增高(P<0.05-P<0.01)，實驗3組PC顯著增高(P<0.05)。 結(jié)論 煙熏不僅可導(dǎo)致大鼠肺組織炎癥加重、肺泡結(jié)構(gòu)破壞，還可導(dǎo)致其骨骼肌組織氧化應(yīng)激損傷。

慢性阻塞性肺疾病；骨骼??；氧化應(yīng)激

慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是人類最常見的致殘和致死性疾病，現(xiàn)為人類第4大死亡病因，該病主要機(jī)制是有害氣體和有害顆粒刺激氣道所產(chǎn)生的氣道的慢性炎癥，最終導(dǎo)致氣流受限。目前發(fā)現(xiàn)慢阻肺除了明顯的呼吸道癥狀之外，還往往伴有全身的癥狀，其中骨骼肌功能障礙近年來受到極大關(guān)注，慢阻肺骨骼肌功能障礙不僅影響患者的活動能力、生活質(zhì)量，而且影響患者的預(yù)后[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)慢阻肺患者的股四頭肌功能明顯受損，并與肺功能分級相關(guān)，肺功能I級、Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級的慢阻肺患者，其股四頭肌功能障礙的發(fā)生率分別為76.5%、95.2%、95.7%、100%[3]。本文通過煙熏法制作慢阻肺大鼠模型，并檢測不同煙熏強(qiáng)度的慢阻肺大鼠伸趾長肌的氧化應(yīng)激損傷的變化，探討慢阻肺骨骼肌功能障礙的機(jī)制。

資料與方法

一、 材料

6周齡的雄性清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠共40只，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附新華醫(yī)院實驗動物中心提供，購自上海西普爾-必凱實驗動物公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2003-0002，使用許可證號：SYXK(滬)2003-0031，體重約250g。

二、方法

1 分組與煙熏：采用隨機(jī)原則分成4組，每組大鼠10只，分別為對照組、實驗1組、實驗2組、實驗3組。實驗組為大鼠煙熏組，分別暴露于不同劑量的香煙煙霧。每組大鼠總共飼養(yǎng)20周，從開始實驗起除對照組正常飼養(yǎng)外，實驗1組煙熏暴露強(qiáng)度為4周(為保持和其它試驗組的可比性，先正常飼養(yǎng)16周，第17周起開始煙熏)、實驗2組煙熏暴露強(qiáng)度為12周(先正常飼養(yǎng)至第9周起煙熏)、實驗3組煙熏暴露強(qiáng)度為20周。每5只大鼠為一個單元飼養(yǎng)，飼養(yǎng)單元為35cm×40cm×50cm (容積70 L) 的有機(jī)透明玻璃箱，煙熏組大鼠每天暴露于10支大前門香煙(上海卷煙廠制造，每支含焦油量12mg，煙氣煙堿量〔尼古丁〕0.9mg，一氧化碳14mg)，每次被動吸煙時間大于30分鐘，一周六天。每天定時記錄進(jìn)食情況，每14天測量大鼠體重與身長。所有大鼠均給予普通飲食飼養(yǎng)，自由進(jìn)水、進(jìn)食。第21周用速眠新0.5mL-0.8mL腹腔注射麻醉，消毒后開胸在麻醉狀態(tài)下經(jīng)心臟抽血致死。

2 氧化應(yīng)激損傷檢測：處死大鼠15分鐘內(nèi)游離雙側(cè)伸趾長肌(Extensor digitorum longus，EDL)放入組織管液氮內(nèi)凍存，統(tǒng)一用ELISA方法檢測各組實驗大鼠的EDL肌組織勻漿丙二醛(MDA)的濃度、EDL肌組織蛋白質(zhì)提取液羰基化蛋白(PC)的濃度，以及EDL肌組織DNA中8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的含量。把不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入相應(yīng)的孔中，37℃孵育2h后洗板。然后依次加入辣根過氧化物酶工作液、標(biāo)準(zhǔn)色液、終止液，用自動酶標(biāo)儀處于30min內(nèi)讀取光密度值(OD)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品MDA、PC、8-OHdG的含量。

3 大鼠肺組織病理檢查：處死大鼠后用10mL的等滲磷酸鹽緩沖液注入右心室灌注肺，當(dāng)紅細(xì)胞被沖走后肺變成白色，取出肺組織，用4%中性福爾馬林固定24h以上。按矢狀面在中、外1/3處取材，經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片。切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗、蘇木素染色等處理，常規(guī)脫水，封片。處理后的標(biāo)本放置放大200倍的顯微鏡下觀察。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、 大鼠肺組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

對照組、實驗1組、實驗2組、實驗3組四組大鼠肺組織病理學(xué)有明顯的改變，隨著煙熏強(qiáng)度的遞增，大鼠肺部組織形態(tài)病理改變越趨明顯。主要病理變化為肺泡毛細(xì)血管充血、肺泡間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤、支氣管周圍肺泡壁炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡壁破壞、肺泡融合。(見圖1-4)。

圖1 對照組大鼠肺部組織病理(×200)，肺組織形態(tài)基本正常，部分區(qū)域血管擴(kuò)張充血 圖2 實驗1組大鼠(煙熏4周)肺部組織病理(×200)，肺泡間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤，部分毛細(xì)血管充血 圖3 實驗2組大鼠(煙熏12周)肺部組織病理(×200)，支氣管周圍見炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管周圍肺泡壁炎癥細(xì)胞浸潤，部分肺泡壁破壞融合 圖4 實驗3組大鼠(煙熏20周)肺部組織病理(×200)，支氣管周圍及肺泡間質(zhì)見有大量炎癥細(xì)胞浸潤，部分肺泡融合，毛細(xì)血管充血

二、 大鼠骨骼肌組織氧化應(yīng)激損傷檢測

表1 不同煙熏強(qiáng)度與對照組大鼠 伸趾長肌氧化應(yīng)激損傷的比較±s)

與對照組比較:▲P<0.05，▲▲P<0.01

與對照組相比，實驗2組、實驗3組MDA、8-OHdG顯著增高(P<0.05-P<0.01)，實驗3組PC顯著增高(P<0.05)。

討 論

氧化應(yīng)激損傷是慢阻肺主要發(fā)病機(jī)制之一[4]。香煙煙霧是一種組成成分非常復(fù)雜的環(huán)境污染物，香煙煙霧中含有大量的活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)，每口香煙煙霧中大約有1017個氧自由基和4700種有害化學(xué)物質(zhì)。卷煙煙霧中的自由基一般分為兩類，即氣相自由基和固相自由基。固相自由基的性質(zhì)一般比較穩(wěn)定，以醌類和半醌類、多環(huán)芳烴自由基為主。氣相自由基非?；顫姡酝樽杂苫屯檠踝杂苫鶠橹?。吸煙的焦油相和氣相煙霧中存在的大量的自由基，它們可以直接或間接地攻擊細(xì)胞成分，甚至殺傷細(xì)胞，導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。在各種由卷煙煙霧導(dǎo)致的疾病中，呼吸道疾病首當(dāng)其沖，尤其是慢阻肺、支氣管肺癌等疾病最受影響[5]。

盡管只有15%的吸煙者最終發(fā)展為慢阻肺，但在慢阻肺的患者中90%有吸煙史。因此，煙熏也是制作慢阻肺動物模型的方法之一。由于香煙煙霧的有害成份可以直接刺激氣道，導(dǎo)致氣道的異常炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，和慢阻肺的發(fā)病機(jī)制相似。本研究大鼠處死后肺組織標(biāo)本制成的病理切片在鏡下所見，對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，而煙熏組光鏡下見大鼠支氣管黏膜及肺泡間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，其中實驗3組尤為明顯，肺泡間質(zhì)和支氣管黏膜下可見大量炎性細(xì)胞浸潤，并可見呼吸細(xì)支氣管、肺泡管、肺泡囊擴(kuò)大，形成小葉中央性肺氣腫，許多肺泡破裂融合，毛細(xì)血管充血明顯。而實驗1組由于煙熏時間較短，其病理改變明顯好于其它兩組(見圖1-4)。本研究通過煙熏導(dǎo)致大鼠氣道和肺組織大量炎性細(xì)胞浸潤、肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞，并且隨著煙熏強(qiáng)度的增加(時間的延長)，肺組織炎癥和肺組織破壞更趨嚴(yán)重，從大鼠病理形態(tài)的變化看本實驗通過煙熏大鼠復(fù)制了慢阻肺動物模型。

氧化應(yīng)激損傷是自由基介導(dǎo)損傷的主要形式。細(xì)胞絕大多數(shù)為膜性結(jié)構(gòu)，不飽和脂肪酸在細(xì)胞膜上大量存在，是最容易受到ROS攻擊的生物分子，它們極易產(chǎn)生過氧化作用。脂類過氧化反應(yīng)產(chǎn)生脂過氧自由基(lipoperoxide radical, LOO.)。LOO.對另一個不飽和脂肪酸抽氫，引發(fā)連鎖反應(yīng)。生物膜中含有多種多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA) ，如花生四烯酸、油酸和亞油酸等。PUFA在ROS的作用下，可在不飽和雙鍵上不斷發(fā)生氧化作用。在這一過程中可以形成許多中間產(chǎn)物，如脂氧自由基(lipoxide radical, LO.)、氫過氧化脂(lipid hydroperoxide, LOOH)、LOO.等，這些中間繼發(fā)產(chǎn)物都屬于ROS。PUFA的過氧化作用常需要消耗大量的氧氣，而最終產(chǎn)物之一是丙二醛(malondialdehyde, MDA)。因此，MDA是脂質(zhì)過氧化的重要指標(biāo)，也是組織氧化應(yīng)激損傷的重要證據(jù)[5-6,8]。

本研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)煙熏后大鼠氣道炎性細(xì)胞浸潤，氣道發(fā)生異常炎癥反應(yīng)。不僅如此，與氣道的遠(yuǎn)隔組織骨骼肌也存在脂質(zhì)過氧化損傷，煙熏12周以上的大鼠骨骼肌組織MDA顯著升高，而煙熏4周的大鼠骨骼肌組織MDA的濃度并未見明顯增高，提示大鼠骨骼肌組織的脂質(zhì)過氧化損傷與煙熏有一定的劑量依賴關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)慢阻肺患者呼出氣冷凝液中MDA明顯升高，且與慢阻肺的嚴(yán)重程度相關(guān)[9]。我國有研究者也發(fā)現(xiàn)用持續(xù)5個月時間氣管內(nèi)滴注彈性蛋白酶制作肺氣腫的動物模型，其腓腸肌中脂褐素(lipofusion)較對照組明顯升高[10]。PUFA的過氧化作用常需要消耗大量的氧氣，而其最終產(chǎn)物之一是MDA，它與蛋白質(zhì)或核酸交聯(lián)后可形成惰性的脂褐素，脂褐素正是自由基介導(dǎo)的蛋白質(zhì)或脂質(zhì)發(fā)生氧化后能激發(fā)出熒光的色素產(chǎn)物。該實驗的數(shù)據(jù)與本實驗的結(jié)果均提示吸煙(或針對氣道的其它損害，如氣道內(nèi)滴注彈性蛋白酶)不僅造成局部呼吸道的損傷，對全身其它遠(yuǎn)隔系統(tǒng)和臟器(如骨骼肌組織)同樣造成脂質(zhì)過氧化損傷。

蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體的重要組成部分，是由多種氨基酸合成的肽鏈生物大分子。蛋白質(zhì)和氨基酸都是容易被ROS攻擊的靶分子，ROS可使蛋白質(zhì)的肽鏈斷裂， ROS還可使蛋白質(zhì)的二級、三級和四級結(jié)構(gòu)破壞，折疊減少，無規(guī)律卷曲增加。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)受上述這些改變后其生物功能發(fā)生很大變化。由于蛋白質(zhì)受到ROS攻擊后必然生成羰基衍生物，蛋白質(zhì)羰基化是指蛋白質(zhì)氨基酸殘基側(cè)鏈中的氨基或亞氨基受到氧自由基攻擊最后轉(zhuǎn)變成醛基,并釋放NH3的過程。蛋白質(zhì)中的賴氨酸、精氨酸、脯氨酸、蘇氨酸殘基都有可能參與羰基化。因此羰基是判斷蛋白質(zhì)是否被氧化的標(biāo)志[11]。本實驗的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)煙熏20周的大鼠骨骼肌組織的羰基化蛋白的含量明顯上升，而12周的煙熏強(qiáng)度雖然使大鼠的氣道出現(xiàn)顯著的炎癥反應(yīng)，但大鼠骨骼肌組織的蛋白質(zhì)氧化應(yīng)激損傷尚不十分顯著，大鼠骨骼肌發(fā)生氧化應(yīng)激損傷明顯存在與煙熏時間的相關(guān)性。我們以往的實驗發(fā)現(xiàn)煙熏3個月的大鼠反映骨骼肌總蛋白降解率的酪氨酸以及反映骨骼肌肌纖維蛋白降解率的3-甲基組胺酸均明顯高于對照組[12-13]。我們推斷盡管煙熏3個月大鼠骨骼肌組織的蛋白質(zhì)氧化應(yīng)激損傷尚不十分明顯，但煙熏大鼠骨骼肌組織蛋白已經(jīng)開始分解加速，并發(fā)生發(fā)生骨骼肌的消耗和萎縮。

核酸尤其是DNA是生物體的重要成分，它帶有生物遺傳信息編碼，能夠控制多種生物功能，如蛋白質(zhì)的合成和遺傳性狀等。ROS能使DNA的雙鏈和(或)單鏈斷裂，使DNA的堿基變成自由基，有ROS產(chǎn)生的DNA氧化損傷可以破壞核酸分子的完整性和構(gòu)型，DNA 氧化的損傷將使細(xì)胞發(fā)生遺傳性改變和功能變化，甚至造成細(xì)胞死亡和癌變。在DNA 氧化的損傷中鳥嘌呤是最易發(fā)生氧化損傷的堿基，鳥嘌呤氧化可發(fā)生在DNA 雙鏈上，在自由基的攻擊下以鳥嘌呤8位碳原子氧化后可形成8-OHdG，DNA鏈上8-OHdG 可以與胞嘧啶以外的其他堿基配對形成點突變，其中GC→TA 突變的發(fā)生已為大量研究所證實。在哺乳動物細(xì)胞中，相當(dāng)數(shù)量的自發(fā)性突變與8-OHdG 有關(guān)。在各種氧化損傷中，以鳥嘌呤8位碳原子氧化后形成8-OHdG最為常見，因此8-OHdG也成為DNA損傷最普遍的標(biāo)志物。作為DNA損傷的副產(chǎn)物，當(dāng)有化學(xué)致癌物刺激時，會產(chǎn)生更多的8-OHdG。同樣的情況也在RNA中發(fā)生，只不過是由鳥嘌呤8位碳原子氧化后形成8-羥基-鳥嘌呤，其也被作為RNA損傷的重要檢測指標(biāo)[14-15]。本實驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn)煙熏12周以上后立即處死的大鼠骨骼肌組織DNA中8-OHdG明顯升高，而煙熏4周和對照組骨骼肌組織DNA中8-OhdG明顯低于其它組，提示大鼠煙熏到一定強(qiáng)度后會造成骨骼肌組織的核酸氧化應(yīng)激損傷。

慢阻肺患者往往伴有骨骼肌萎縮和功能障礙，導(dǎo)致骨骼肌肌力和耐力下降，直接影響著疾病的進(jìn)展和預(yù)后，近年來慢阻肺患者的骨骼肌功能障礙引起了愈來愈多的學(xué)者的關(guān)注[1-3]。其分子生物學(xué)機(jī)制較為復(fù)雜，為多機(jī)制共同參與所致[17-18]。本研究對實驗大鼠分別煙熏4-20周，目的是觀察不同煙熏強(qiáng)度對大鼠骨骼肌組織氧化應(yīng)激損傷的影響。香煙煙霧中含有大量的ROS，可以造成機(jī)體氣道的氧化應(yīng)激負(fù)荷加重，氧化應(yīng)激是當(dāng)生物體內(nèi)ROS的生成與清除平衡狀態(tài)被破壞后而導(dǎo)致ROS增加的過程，當(dāng)各種因素打破這一平衡而導(dǎo)致ROS濃度超過生理限度時就會發(fā)生生物大分子損傷，造成靶細(xì)胞、靶組織甚至靶器官氧化應(yīng)激損傷。已有研究發(fā)現(xiàn)慢阻肺的氧化應(yīng)激負(fù)擔(dān)加重是全身性的，并不僅僅只累及呼吸系統(tǒng)[19]。上述的研究證實香煙煙霧暴露至一定時間和強(qiáng)度后會導(dǎo)致大鼠氣道發(fā)生異常炎癥反應(yīng)，這種反應(yīng)同時也會導(dǎo)致遠(yuǎn)隔組織——骨骼肌組織的氧化應(yīng)激負(fù)荷加重，包括骨骼肌組織的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA/RNA的氧化損傷。

目前關(guān)于“慢阻肺是一種呼吸道疾病，同時又具有系統(tǒng)性表現(xiàn)，常合并體重下降、營養(yǎng)不良、骨骼肌功能障礙，而后者又是慢阻肺預(yù)后的重要因素”的觀念已達(dá)成共識[20]。氧化應(yīng)激是慢阻肺重要的發(fā)病機(jī)制之一，也已被廣泛認(rèn)同[5-6]。本研究的結(jié)果數(shù)據(jù)提示煙熏刺激可使骨骼肌組織發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，也間接提示慢阻肺患者的系統(tǒng)性表現(xiàn)與氧化應(yīng)激負(fù)荷加重，并最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

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Study on oxygen stress damage of skeletal muscle in chronic obstructive pulmonary disease model rats with different intensities of passive cigarette smoking

LUOYong,PANJun,CHENGYi,HANFeng-feng

DivisionofRespiratoryMedicine,XinhuaHospitalChongmingBranchAffiliatedtoMedicineSchoolofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai202150,China

Objective To study the oxygen stress damage of skeletal muscle in chronic obstructive pulmonary disease model rats with different intensities of passive cigarette smoking. Methods 40 rats were divided into 4 groups averagely: the control group, the trial 1 group, the trial 2 group and the trail 3 group. The trial 1, 2 and 3 groups were exposed to passive cigarette smoking for 4 weeks, 12 weeks and 20 weeks respectively. Lung tissue specimens were observed and MDA , PC and 8-OHdG in the extensor digitorum longus of rats were detected through ELISA. Results Inflammatory cells infiltration and alveolar rupture could be seen by light microscope in the lung tissue specimens of rats increasing proportionally to length of time of exposure to cigarette smoking. MDA, 8-OHdG in the trial 2, 3 groups and PC in the trial 3 group increased significantly while compared with the control group (P<0.05-P<0.01). Conclusion Cigarette smoking not only can cause inflammation in the lung and destruction of alveolar, but also result in oxygen stress damage in the distal skeletal muscle tissue.

chronic obstructive pulmonary disease; skeletal muscle; oxygen stress

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.02.017

上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會資助課題(No 20134141)

1. 202150 上海，上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院崇明分院呼吸科

2. 202150 上海，上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院呼吸科

2016-06-27]