賀兼斌 劉理靜 向志 肖集文 肖海波

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Nucleophosmin及notch1在肺腺癌中的表達(dá)及意義

賀兼斌1劉理靜4向志1肖集文2肖海波3

目的 觀察Nucleophosmin蛋白及notch1受體蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)并探討其意義。方法 選擇2012，10-2015，06我院確診的肺腺癌患者的腫瘤標(biāo)本共107例，采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)Nucleophosmin蛋白和notch1受體蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。結(jié)果 Nucleophosmin蛋白和Notch1受體蛋白質(zhì)在肺腺癌組織中皆為陽(yáng)性表達(dá)，臨床分期越高，Nucleophosmin蛋白和Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(dá)越高，同時(shí)Nucleophosmin蛋白和Notch1受體蛋白質(zhì)在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)隨分化程度的升高而降低。結(jié)論 Nucleophosmin、Notch1受體蛋白質(zhì)在肺腺癌組織中的高表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)，兩者的過(guò)表達(dá)可能促進(jìn)肺腺癌的進(jìn)展，侵襲及轉(zhuǎn)移。

Nucleophosmin；Notch1；肺腺癌；轉(zhuǎn)移

肺癌是危害人類(lèi)生命的惡性腫瘤之一，中晚期肺癌因轉(zhuǎn)移或瘤體大而無(wú)手術(shù)機(jī)會(huì)，綜合治療的主要手段是化療，但到目前為止，5年生存率仍然很低，不超過(guò)15%，治療失敗的主要原因包括化療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中，許多基因及基因產(chǎn)物參與了腫瘤的進(jìn)展過(guò)程，其中某些基因及基因產(chǎn)物與腫瘤的侵襲，轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，探尋這些基因及基因產(chǎn)物有利于揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)理，并使其成為腫瘤靶向治療潛在的靶標(biāo)，有可能為腫瘤的治療開(kāi)辟新的治療途征。有研究表明Nucleophosmin、Notch1受體與某些腫瘤的生長(zhǎng)，侵襲，轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1-2]，但它們與肺腺癌的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究收集足夠樣本量的經(jīng)過(guò)病理學(xué)確診的肺腺癌患者腫瘤組織標(biāo)本，以免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤組織中Nucleophosmin、Notch1受體表達(dá)，探討其與肺腺癌發(fā)生，發(fā)展的關(guān)系。

資料與方法

一、一般資料

選擇2012，10-2015，06我院經(jīng)電子支氣管鏡活檢、CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺肺活檢或轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)活檢及外科手術(shù)確診的肺腺癌患者的腫瘤標(biāo)本共107例。其中男41例，女66例，年齡41-76歲，平均56.7歲，依據(jù)2009年第7版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期15例，Ⅱ期34例，Ⅲ期39例，Ⅳ期19例，低分化31例，中分化43例，高分化33例。所有標(biāo)本均用10%中性甲醛溶液固定并石蠟包埋保存于我院病理標(biāo)本庫(kù)，行4um連續(xù)切片，由2 位有經(jīng)驗(yàn)的病理專(zhuān)家確診，符合2015年的WHO腫瘤組織學(xué)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[3]及2011年IASLC/ATS/ERS肺腺癌新分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[4]。

二、主要試劑

一抗小鼠抗人Nucleophosmin單克隆抗體和羊抗人Notch1 多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司，免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒及DAB顯色劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

三、免疫組織化學(xué)檢測(cè)

對(duì)入選病例的腫瘤組織及癌旁組織標(biāo)本使用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Nucleophosmin、Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(dá)，分析Nucleophosmin、Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(dá)與腫瘤臨床及病理分期的關(guān)系。免疫組織化學(xué)檢測(cè)步驟按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行，一抗分別為小鼠抗人Nucleophosmin單克隆抗體、羊抗人Notch1 多克隆抗體，抗體稀釋濃度為1 ∶100，陰性對(duì)照為用PBS緩沖液代替一抗。結(jié)果判斷：Nucleophosmin蛋白為腫瘤細(xì)胞胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒,Notch1受體蛋白質(zhì)為腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)及細(xì)胞膜上呈棕黃色顆粒，蛋白表達(dá)結(jié)果采用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定平均灰度值表示，平均灰度值越高，蛋白表達(dá)越強(qiáng)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、不同臨床分期患者腫瘤中Nucleophosmin、Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(dá)

Nucleophosmin蛋白的表達(dá)：肺腺癌各臨床分期標(biāo)本Nucleophosmin皆為陽(yáng)性表達(dá)，隨腫瘤進(jìn)展，臨床分期越高，Nucleophosmin的表達(dá)越高，Ⅰ期與Ⅱ期比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)，其它各期比較有差異顯著性(P<0.05)，Nucleophosmin蛋白在癌旁組織中表達(dá)極低，與腫瘤組織比較有差異顯著性(P<0.05)；Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(dá)：肺腺癌各臨床分期標(biāo)本Notch1受體蛋白質(zhì)皆為陽(yáng)性表達(dá)，與Nucleophosmin蛋白的表達(dá)類(lèi)似，隨腫瘤進(jìn)展，臨床分期越高， Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(dá)越高，各期比較有差異顯著性(P<0.05)，而癌旁組織中表達(dá)極低，與腫瘤組織比較有差異顯著性(P<0.05)，各臨床分期患者腫瘤中Nucleophosmin、Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(dá)(見(jiàn)表1，圖1)。

表1 不同臨床分期患者腫瘤中Nucleophosmin、 Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(dá)

二、不同分化程度患者腫瘤中Nucleophosmin、Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(dá)

圖1 不同臨床分期患者腫瘤中Nucleophosmin蛋白質(zhì)和Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(dá)(SP×100)

Nucleophosmin在肺腺癌細(xì)胞的表達(dá)隨分化程度的升高而降低，低分化肺腺癌表達(dá)最高，高分化肺腺癌表達(dá)最低，各組間比較有差異顯著性(P<0.05)；Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(dá)與Nucleophosmin表達(dá)類(lèi)似，各組間比較有差異顯著性(P<0.05)，各分化程度患者腫瘤中Nucleophosmin、Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(dá)(見(jiàn)表2，圖2)。

圖2 不同分化程度患者腫瘤中Nucleophosmin蛋白質(zhì)和Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(dá)(SP×100)表2 不同分化程度患者腫瘤中Nucleophosmin、 Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(dá)

分化程度nNucleophosmin灰度值Notch1灰度值低分化31147.02±6.19139.26±5.43中分化4389.77±4.8186.37±4.52高分化3365.14±4.2361.58±4.39

討 論

肺癌是惡性程度較高的腫瘤，它嚴(yán)重?fù)p害患者的健康和生命，其發(fā)病率和死亡率皆高，是發(fā)病率和死因第一位的惡性腫瘤[5-6]。在上世紀(jì)中葉，鱗癌是肺癌的主要組織學(xué)亞型，腺癌所占比例極少僅約為5%，但近年來(lái)，肺腺癌的發(fā)病率在快速上升[6]。因肺腺癌組織內(nèi)血管豐富，淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移早，進(jìn)展快，導(dǎo)致療效差，預(yù)后不佳，因此，探尋肺腺癌的有效治療方案或?qū)ふ移錆撛诘闹委煱袠?biāo)具有重要的意義。惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展與多種癌基因及基因產(chǎn)物過(guò)度表達(dá)，以及腫瘤抑制基因失活或基因產(chǎn)物的缺失密切相關(guān)[7-8]，因此, 進(jìn)一步研究新的基因功能改變與肺癌發(fā)生發(fā)展及其惡性特征的關(guān)系，對(duì)進(jìn)一步揭示肺癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)理、設(shè)計(jì)合理的治療藥物抑制肺癌細(xì)胞浸潤(rùn)或增強(qiáng)其對(duì)放化療的敏感性及判斷患者預(yù)后和提高我國(guó)肺癌的治療水平都具有積極意義。既往有較多研究表明Nucleophosmin、Notch1受體參與了某些腫瘤的生長(zhǎng)，侵襲和轉(zhuǎn)移[1-2]，但它們與肺腺癌的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)檢測(cè)Nucleophosmin和Notchl在肺腺癌組織中的表達(dá)，試圖初步分析與其與肺腺癌發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

Nucleophosmin是主要的核仁磷酸化蛋白，它參與了rRNA前體加工、RNA裝配及合成、染色體復(fù)制、調(diào)節(jié)抑癌基因p53和p14的活性及作為分子伴侶防止蛋白集聚等病理和生理過(guò)程，Nucleophosmin還參與監(jiān)控核仁活性及細(xì)胞增殖[9-10]。有研究[11-12]表明Nucleophosmin在多種腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)，具有促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和抑制凋亡的作用，其高水平表達(dá)與惡性腫瘤的進(jìn)展階段呈正相關(guān)，Nucleophosmin在多種實(shí)體腫瘤中存在過(guò)度表達(dá)，甚至可作為胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和前列腺癌的腫瘤標(biāo)志物，但其與肺癌的關(guān)系少見(jiàn)報(bào)道，未見(jiàn)Nucleophosmin與肺癌發(fā)生發(fā)展及侵襲和轉(zhuǎn)移的研究報(bào)道。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Nucleophosmin在肺腺癌中的表達(dá)隨患者的臨床分期的升高而增加，除Ⅰ期和Ⅱ期之間比較無(wú)顯著性差異外，其它各組比較皆有顯著性差異(P<0.05)，在各分化程度肺腺癌比較，隨分化程度降低，Nucleophosmin在肺腺癌中的表達(dá)增加，各組間比較有顯著性差異(P<0.05)，不同臨床分期和不同分化程度的肺腺癌組織中Nucleophosmin蛋白的表達(dá)均存在差異，且隨著臨床分期的升高和細(xì)胞分化程度的降低，染色程度不斷加深，Nucleophosmin蛋白表達(dá)的灰度值升高，這可能與腫瘤細(xì)胞后期的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系。以上結(jié)果表明Nucleophosmin在肺腺癌中具有類(lèi)似癌基因的功能，檢測(cè)Nucleophosmin的表達(dá)情況可能對(duì)肺癌早期診斷、指導(dǎo)治療、預(yù)后預(yù)測(cè)有一定價(jià)值。但Nucleophosmin在腫瘤進(jìn)展中的具體作用機(jī)制還不完全明了，可能與Nucleophosmin可以導(dǎo)致c-myc穩(wěn)定性增強(qiáng)，p53 基因失活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)[13-14]，也可能與Nucleophosmin通過(guò)促進(jìn)PCNA的表達(dá)促細(xì)胞增殖有關(guān)[15]。Notch是一種單次跨膜受體蛋白，Notch信號(hào)通路具有高度保守性，許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展均與Notch信號(hào)通路失調(diào)有關(guān)，其中Notch1是Notch信號(hào)通路中的重要受體，在多種腫瘤形成中發(fā)揮重要作用[16-17]。有研究報(bào)道在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)Notch1的異常表達(dá)，但它在不同腫瘤中發(fā)揮的作用卻并不相同，在某些腫瘤中呈現(xiàn)促癌作用，可是在另一些腫瘤中卻呈抑癌作用，也有研究表明即使在同一種腫瘤發(fā)生的不同時(shí)期Notch1起的作用也不相同[18-19]，近年來(lái)Notch1在肺癌中的作用也逐漸成為研究熱點(diǎn)，有研究表明Notchl在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈正相關(guān)[20]，本研究中發(fā)現(xiàn)，Notchl在肺腺癌的表達(dá)隨臨床分期的升高而升高，各組間比較有顯著性差異(P<0.05)，同時(shí)隨細(xì)胞分化的減低而增加，各組間比較有顯著性差異(P<0.05)，本研究發(fā)現(xiàn)在肺腺癌組織中Notch-1的陽(yáng)性表達(dá)隨臨床分期明顯上調(diào)，表明Notch-1在肺腺癌的發(fā)生過(guò)程中起到了促癌作用，另發(fā)現(xiàn)Notch-1的表達(dá)隨肺腺癌分化程度降低而增高，推測(cè)Notch-1可能通過(guò)抑制細(xì)胞分化促進(jìn)肺腺癌的發(fā)展， Notch-1高表達(dá)與肺腺癌組織分期、病理分級(jí)、臨床分期具有相關(guān)性，說(shuō)明其與肺腺癌的惡性程度及侵襲性呈正相關(guān)，Notch-1促進(jìn)肺腺癌發(fā)生，發(fā)展，侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與Notch信號(hào)通路參與上調(diào)VEGF，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合核因子NF-κB 抑制因子，上調(diào)NF-κB等促進(jìn)腫瘤微血管的形成，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖[20]有關(guān)， 而Notch-1在腫瘤中的不同作用可能與腫瘤細(xì)胞類(lèi)型、生長(zhǎng)背景和腫瘤干細(xì)胞有關(guān)[21]。

綜上所述，Nucleophosmin、Notch1受體蛋白質(zhì)在肺腺癌組織中的異常高表達(dá)可能促進(jìn)肺腺癌的進(jìn)展，侵襲及轉(zhuǎn)移，兩者可能成為新的評(píng)價(jià)肺腺癌腫瘤患者預(yù)后的指標(biāo)和治療新靶點(diǎn)，但兩者在肺腺癌中的具體作用機(jī)制及兩者的交互作用有待于進(jìn)一步研究。

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Expression and significance of Nucleophosmin and Notch1 in lung adenocarcinoma

HEJian-bin,LIULi-jing,XIANGZhi,XIAOJi-wen,XIAOHai-bo

DepartmentofRespiration,theFirstPeople'sHospitalofHuaihua,Huaihua,Hu'nan418000,China

Objective To observe the expression of Nucleophosmin protein and Notch1 receptor protein in lung adenocarcinoma and to discuss its significance. Methods A total of 107 patients with lung adenocarcinoma, who were admitted to our hospital from October 2012 to June 2015, were enrolled in the study. Immunohistochemical assay was used to analyze the expression of Nucleophosmin protein and Notch1 receptor protein in lung adenocarcinoma. Results Nucleophosmin protein and Notch1 receptor protein were positive expression in lung adenocarcinoma, and the expression of Nucleophosmin protein and Notch1 receptor protein was higher at high clinical stage than at low clinical stage, while it in tumor cells decreased with the rise of differentiation degree of the tumor. Conclusion The high expression of Nucleophosmin protein and Notch1 receptor protein in lung adenocarcinoma may be closely related with tumor occurrence, development, invasion and metastasis. The over expression of them in lung adenocarcinoma may promote progress, invasion and metastasis.

Nucleophosmin; Notch1; lung adenocarcinoma; metastasis

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.02.004

湖南省衛(wèi)生廳科研基金(No B2013-157)

1. 418000 湖南 懷化，懷化市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 2. 418000 湖南 懷化，懷化市第一人民醫(yī)院腫瘤中心 3. 418000 湖南 懷化，懷化市第一人民醫(yī)院病理科 4. 418000 湖南 懷化，湖南醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院

2016-07-06]