薛克營 柯明耀 吳雪梅 趙年貴 林巖 沈杰芳

?

·論 著·

吉西他濱納米磁靶向藥囊對(duì)肺癌相關(guān)蛋白P53表達(dá)的影響

薛克營 柯明耀 吳雪梅 趙年貴 林巖 沈杰芳

目的 觀察吉西他濱納米磁靶向藥囊對(duì)肺鱗癌細(xì)胞株A2裸鼠移植瘤模型的抑瘤率、血常規(guī)、肝腎功能和P53的表達(dá)變化探討其療效、安全性和抑制肺癌的機(jī)制。方法 將植入肺鱗癌細(xì)胞株A2的肺癌裸鼠模型分為5組NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組、NiTi合金支氣管支架+化療藥物組、納米磁靶向藥囊組、化療藥物組和未干預(yù)組。觀察各組腫瘤抑制率、血常規(guī)和肝腎功能,采用RT-PCR和western blot方法檢測(cè)各組在藥物干預(yù)后P53的表達(dá)情況。結(jié)果 NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組腫瘤抑制最明顯，骨髓抑制和肝功能損傷最輕；NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組P53水平與未干預(yù)組相比顯著降低(P<0.01)；NiTi合金支氣管支架+化療藥物組、納米磁靶向藥囊組、化療藥物組的P53與未干預(yù)組相比有差異性(P<0.05)；三者之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論 吉西他濱納米磁靶向藥囊抑瘤作用明顯，毒副作用輕，可能通過下調(diào)P53表達(dá)而發(fā)揮抑制肺癌的作用。

納米磁靶向藥囊; 吉西他濱; 肺癌；P53

抗腫瘤納米藥物可將化療藥物靶向性帶入目標(biāo)部位進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用[1-3]。在外部磁場(chǎng)作用下，納米磁小體藥物聚集于靶組織從而提高藥物的靶向性。磁化的NiTi合金支氣管支架具有較好的磁性，可通過纖支鏡植入到肺癌病灶處，再給患者應(yīng)用納米磁小體靶向藥囊，則納米磁小體靶向藥囊就可以附著在支架上，實(shí)施靶向局部給藥，達(dá)到降低藥物副作用、提高療效的目的。P53蛋白與人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，本研究通過檢測(cè)不同處理后肺鱗癌細(xì)胞株A2移植瘤模型的腫瘤抑制率、血常規(guī)、肝腎功能和P53的表達(dá)變化,探討其療效、安全性和抑制肺癌的機(jī)制。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株

SPF級(jí)裸小鼠50只，6周齡、雄性，體質(zhì)量18g-20g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK(滬) 2015-0006；人肺鱗癌A2細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

二、藥物與試劑

吉西他濱(江蘇豪森藥業(yè)公司)、NiTi合金支氣管支架(南京微創(chuàng))、RMPI-1640(GIBCO, USA)、優(yōu)級(jí)胎牛血清(GIBCO,USA)、TRIZOL試劑(Invitrogen)等, P53及β-actin引物由華大基因合成。

三、細(xì)胞培養(yǎng)

將人肺鱗癌A2細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清RMPI-1640培養(yǎng)基中于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

四、肺癌裸鼠模型的建立

將培養(yǎng)好的A2細(xì)胞用PBS稀釋至濃度為1×107個(gè)/mL。取0.2mL上述細(xì)胞懸液接種于裸鼠右股外側(cè)皮下。移植后20d(挑選腫瘤體積均約在72.5mm3左右的裸鼠)作為肺癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

五、實(shí)驗(yàn)分組

將50只裸鼠肺癌模型平均分成NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組、NiTi合金支氣管支架+化療藥物組、納米磁靶向藥囊組、化療藥物組和未干預(yù)組，手術(shù)植入NiTi合金支氣管支架于腫瘤中，通過尾靜脈單次注入納米磁靶向藥囊或化療藥物。其中吉西他濱有效劑量均按45 mg/kg 給予，正常對(duì)照組尾靜脈注射同量的生理鹽水處理，連續(xù)給藥10天。

六、腫瘤抑制和毒副作用觀察

裸鼠自接種后每天觀察荷瘤鼠存活和精神狀況，以游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長徑(a) 和最短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積(V)，V=0.52×a×b2, 繪制腫瘤生長曲線。給藥第11天脫頸處死小鼠，分離移植瘤并計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=(對(duì)照組-治療組)/對(duì)照組×100%；采集小鼠的血液，行血常規(guī)和肝腎功能檢測(cè)。

七、RT-PCR檢測(cè)P53表達(dá)

給藥第11天脫頸處死小鼠，取各組小鼠的腫瘤組織按照trizol法提取組織總RNA后，通過酶標(biāo)儀測(cè)定其260nm和280nm的OD值計(jì)算RNA的濃度。取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA，然后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。β-actin上游引物:5′-GCTCGTCG TCGACAACGGCTG-3′,下游引物: 5′-CAAACATG ATCTGGGTCATCTTTTC-3′；p53上游引物：5′-CACGTACTCTCCTCCCCTCAATA-3，下游引物：5′-TCTTCCAGTGTGATGATGGTAAGG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，36個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃ 5min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用凝膠圖像分析軟件測(cè)定目的條帶和β-actin的灰度值，以兩者的比值表示RT-PCR目的產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)量。 Western blot檢測(cè)P53表達(dá)。

八、 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、腫瘤抑制和毒副作用觀察結(jié)果

各給藥組小鼠狀態(tài)良好，注射局部正常。由腫瘤生長曲線和抑瘤率可見各處理組的腫瘤生長均受到不同程度抑制，以NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組生長最為緩慢，腫瘤抑制最為明顯，化療藥物組、納米磁靶向藥囊組和NiTi合金支氣管支架+化療藥物組相當(dāng)(見圖1、表1)。

圖1 不同藥物處理對(duì)小鼠腫瘤生長的影響表1 不同藥物處理對(duì)小鼠腫瘤生長的影響±s)

組別n/只腫瘤體積/cm3瘤重/g抑瘤率/%未干預(yù)組109.05±1.81 1.41±0.67 -化療藥物104.35±0.98*1.02±0.18Δ28◇納米磁藥囊103.88±1.04**0.88±0.63ΔΔ38◇◇Niti支架+化療藥物104.01±1.79***0.94±0.36ΔΔΔ33◇◇◇Niti支架+納米磁藥囊102.04±0.28****0.58±0.20ΔΔΔΔ59◇◇◇◇

與未干預(yù)組相比，*P、ΔP、◇P<0.05，**P、ΔΔP、◇◇P<0.05，***P、ΔΔΔP、◇◇◇P<0.05，◇◇◇P、ΔΔΔΔP、◇◇◇◇P<0.05；與NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組相比，*P、ΔP、◇P<0.05，**P、ΔΔP、◇◇P<0.05，***P、ΔΔΔP、◇◇◇P<0.05

治療10d后，與未干預(yù)組相比，各治療組小鼠白細(xì)胞、血小板均顯著降低(P<0.05)，但以NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組降低最少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；紅細(xì)胞、血紅蛋白5組間無明顯差異，P>0.05，(見表2)。與未干預(yù)組相比，各治療組小鼠丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量升高(P<0.05)，但以NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組升高最少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)差異不顯著，P>0.05，(見表3)。

表2 治療后血常規(guī)比較

與未干預(yù)組相比，*P、ΔP<0.05，**P、ΔΔP<0.05，***P、ΔΔΔP<0.05，****P、ΔΔΔΔP<0.05；與NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組相比，*P、ΔP<0.05，**P、ΔΔP<0.05，***P、ΔΔΔP<0.05

表3 治療后肝腎功能比較

與未干預(yù)組相比，*P、ΔP<0.05，**P、ΔΔP<0.05，***P、ΔΔΔP<0.05，****P、ΔΔΔΔP<0.05；與NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組相比，*P、ΔP<0.05，**P、ΔΔP<0.05，***P、ΔΔΔP<0.05

二、RT-PCR檢測(cè)P53 mRNA表達(dá)的變化

NiTi合金支氣管支架+化療藥物組、納米磁靶向藥囊組、化療藥物組三組間表達(dá)無明顯差異，與未干預(yù)組比較明顯減弱(P<0.05), NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組較未干預(yù)組表達(dá)下降極顯著P<0.01。(見圖2)。

三、Western blotting檢測(cè)P53蛋白表達(dá)

與未干預(yù)組相比，化學(xué)藥物組、納米磁靶向藥囊組和NiTi合金支氣管支架+化療藥物組明顯降低(P<0.05)，NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組極顯著下降，P<0.01。(見圖3)。

討 論

吉西他濱是一種抗腫瘤藥物,在人和小鼠體內(nèi)可以抑制核苷酸還原酶的合成,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脫氧核苷三磷酸酯減少,其主要作用于細(xì)胞增殖中G1/S期,進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，并對(duì)小鼠多種腫瘤有效。在吉西他濱作用于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系 NH460 和NH322 的研究中,Tohis 等[4]發(fā)現(xiàn)吉西他濱引起具有 Wt-p53 的NH460 細(xì)胞P53 的表達(dá),當(dāng)吉西他濱使用劑量很低時(shí),其依賴于P53的作用,而使腫瘤細(xì)胞聚集在G1期,當(dāng)使用劑量很高時(shí),其會(huì)引起P53 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制。

圖2 各治療組治療10d后P53 mRNA表達(dá)結(jié)果

A：NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組;B：NiTi合金支氣管支架+化療藥物組；C：納米磁靶向藥囊組；D：化療藥物組；E：未干預(yù)組。*P<0.05；***P<0.01。

圖3 各治療組治療10d后P53蛋白表達(dá)結(jié)果

A：未干預(yù)組(B: 化療藥物組；C: 納米磁靶向藥囊組；D：NiTi合金支氣管支架+化療藥物組；E：NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組。*P<0.05；***P<0.01

納米靶向藥物載體是靶向治療腫瘤的有效載體形式,主要是借助于磁場(chǎng)效應(yīng)使藥物聚集在靶位點(diǎn)。不僅可以有效提高治療效果,還可以減少藥物的毒副作用。納米磁靶向藥物是由磁場(chǎng)、高分子骨架材料和化療藥物組成。Lubbe等[5]利用Fe2O3作為磁場(chǎng),表面覆蓋多聚淀粉制成磁性納米小粒,通過靜脈注射,再結(jié)合外磁場(chǎng)的作用,可以靶向治療小鼠腫瘤。2000年,Alexion等[6]利用磁性納米粒靶向治療后肋中部植入VX2鱗狀上皮癌的新西蘭大白鼠,經(jīng)過靶向治療35d后,26只上皮癌模型小鼠的腫瘤完全消失,且完全沒有副作用。2003年,他們進(jìn)一步利用放射性同位素標(biāo)記磁性納米粒,探究納米粒藥物在體內(nèi)的分布情況。隨后他們又從細(xì)胞水平證明磁性納米粒在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)磁性納米粒靶向治療后的腫瘤組織中藥物的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通化療藥物濃度[7]。

多種化療藥物主要通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)而起到對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。腫瘤抑制因子p53在不同的刺激下分別調(diào)節(jié)細(xì)胞周期或者細(xì)胞凋亡。它不但可以通過轉(zhuǎn)錄活化許多靶基因如P21、Bax、p53DINP1、Puma等，而且還可以通過轉(zhuǎn)錄非依賴的形式來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。P53在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，降低腫瘤組織中P53的表達(dá)對(duì)腫瘤治療有著重要意義。

因研究動(dòng)物限制，部分檢測(cè)無法自身前后對(duì)比，因此多對(duì)照未干預(yù)組統(tǒng)計(jì)。本研究通過制備肺癌裸鼠模型進(jìn)行不同方式的化療藥物治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過腫瘤內(nèi)植入磁場(chǎng)結(jié)合納米磁靶向藥物的方式可以顯著降低P53蛋白的表達(dá)，說明納米磁靶向藥囊可以更大程度抑制組織局部腫瘤P53蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤的生長。研究結(jié)果也顯示，在各給藥組小鼠狀態(tài)均良好，局部尾靜脈注射也正常的情況下，以NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組腫瘤生長最為緩慢，對(duì)骨髓抑制和肝功能的損傷程度最輕，說明該治療方法療效高，毒副作用輕，為進(jìn)一步將內(nèi)置磁場(chǎng)結(jié)合納米磁靶向藥物抑制人中央型肺癌的生長奠定了很好的基礎(chǔ)。

目前,國內(nèi)外磁性納米粒靶向藥物治療腫瘤整體發(fā)展水平還處于基礎(chǔ)階段,還存在許多不足和困難。① 由于病變器官和正常器官生物學(xué)行為不同,磁性納米粒靶向藥物應(yīng)用于具體器官還必須優(yōu)化藥動(dòng)力學(xué)特征。② 突破磁場(chǎng)強(qiáng)度和梯度的限制,隨著高梯度磁性分離原理[8]的應(yīng)用,有望克服這一限制。③ 探索利用磁性靶向途徑從基因水平治療腫瘤,提高靶基因轉(zhuǎn)染的速度和效率[9]。

[1] Roco MC. Environmentally responsible development of nanotecknology[J]. Environ Sci Technol, 2005, 39(5):106A-112A.

[2] Ravi Kumar MN. Nano and microparticles as controlled drug delivery devices[J]. J Pharm Pharm Sci, 2000, 3(2):234-258.

[3] Sahoo SK, Labhasetwar V. Nanotech approaches to drug delivery and imaging[J]. Drug Discov Today, 2003, 8(24):1112-1120.

[4] Tolis C, Peters G(Ferreira CG, et al. Cell cycle disturbances and apoptosis induced by topotecan and gemcitablne on human lung cancer cell lines[J]. Eur J Cancer, 1999, 35(5):796-807.

[5] Lubbe AS，Bergemann C，Brock J，et al．Physiological aspects in magnetic drug-targeting[J]．J Magn Magn Mater, 1999, 194(1-3):149-155．

[6] Alexiou C,Arnold W,Klein RJ,et al. Locoregional cancer treatment with magnetic drug targeting[J]. Cancer Res, 2000, 60 (23):6641-6648.

[7] Alexiou C，Jurgons R，Schmid R，et al．In vitro and in vivo investigations of targeted chemotherapy with magnetic nanopticles[J]．J Magn Magn Mater, 2005, 293(1):389-393．

[8] Rosengart AJ，Kaminski MD，Chen H，et al．Magnetizable implants and functionalized magnetic carriers：A novel approach for noninvasive yet targeted drug delivery[J]．J Magn Magn Mater, 2005, 293(1):633-638．

[9] Scherer F, Anton M, Schillinger U, et al. Magnetofection enhancing and targeting gene delivery by magnetic force in vitro and in vivo[J]. Gene Ther, 2002, 9(2):102-109.

Effect of Gemcitabine nano-magnetic targeting capsule on P53 expression in lung cancer

XUEKe-ying,KEMing-yao,WUXue-mei,ZHAONian-gui,LINYan,SHENJie-fang

RespiratoryCenter,theSecondHospitalAffiliatedtoXiamenMedicalCollege,Xiamen,Fujian361021,China

Objective To observe the effect of Gemcitabine nano-magnetic targeting capsule on tumor inhibition rate, blood routine, liver function, renal function and P53 expression in lung cancer cell line A2 of nude mice model, and to explore its curative effect, safety and mechanism of inhibiting tumor. Methods Lung cancer model mice which were injected with lung cancer cell Line A2 were divided into five groups: the NiTi alloy bronchial stent and nano-magnetic targeting drug group, the NiTi alloy stent and chemotherapy group, the nano-magnetic targeting drug group, the chemotherapy group and the untreated group. Thier tumor inhibition rate, blood routine, liver function and renal function were observed. RT-PCR and western blot were used to detect the expression of mRNA and P53 protein. Results The NiTi alloy bronchial stent group and the nano-magnetic targeting drug group had more significant tumor inhibition effect, and less myelosuppression and liver and kidney injury. Compared the with untreated group, the expression of P53 in the NiTi alloy bronchial stent group and the nano-magnetic targeting drug group was decreased significantly (P<0.01). The expression of p53 in the NiTi alloy stent group and the chemotherapy group, the nano-magnetic targeting drug group also decreased (P<0.05). Conclusion Nano-magnetic targeting drug has better curative effect and fewer side effects on lung cancer inhibition of mice, which may attribute to the down regulation of P53.

nano-magnetic targeting drug; gemcitabine; lung cancer; P53

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.02.001

福建省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No 2011D010)

361021 福建 廈門，廈門醫(yī)學(xué)院附屬廈門市第二醫(yī)院廈門市呼吸中心

2016-02-07]