朱曉靜 ， 王金花 ， 廖承紅 ， 徐永昊 ， 韓 謙

(海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院 ， 海南 ?？?570228)

犬惡絲蟲(chóng)病是由蚊子傳播的線(xiàn)蟲(chóng)類(lèi)絲蟲(chóng)病，能對(duì)其終末宿主-家犬(犬屬)和野生犬科動(dòng)物(山狗和狼等)造成嚴(yán)重的心肺疾病，除犬外，貓和其他野生肉食動(dòng)物均可作其終末宿主。動(dòng)物的感染病例已出現(xiàn)在除南極洲以外的各大洲，在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛流行，且流行時(shí)間比溫帶和寒帶長(zhǎng)。由于蚊蟲(chóng)是本病的傳播媒介，特別是在熱帶地區(qū)，蚊蟲(chóng)一年四季都很活躍，而海南地處熱帶地區(qū)，該病幾乎可全年流行。在我國(guó)的北京、上海、重慶、廣東、福建、浙江、湖北、四川、云南、山東、遼寧、內(nèi)蒙古和深圳等27個(gè)省和直轄市已有犬惡絲蟲(chóng)感染動(dòng)物的報(bào)道[1]。而人患該病的確診病例數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)，2005年在中國(guó)有2 例人體感染犬惡絲蟲(chóng)病例[2]。而到了2012年，香港有3例人感染了新型犬惡絲蟲(chóng)病病例[3]，犬惡絲蟲(chóng)病已成為潛在的嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的新發(fā)人獸共患寄生蟲(chóng)病。但迄今為止，未見(jiàn)到海南犬心絲蟲(chóng)病流行病學(xué)的相關(guān)報(bào)道。

沃爾巴克氏體(Wb)是共生于犬惡絲蟲(chóng)體內(nèi)的內(nèi)共生菌，在絲蟲(chóng)發(fā)育的各個(gè)階段均存在，當(dāng)犬惡絲蟲(chóng)死亡后，向機(jī)體釋放出大量的Wb，在心絲蟲(chóng)病治療前減少沃爾巴克的水平有利于減少絲蟲(chóng)引起的不良病理反應(yīng)，故Wb為犬惡絲蟲(chóng)的致病機(jī)理以及診療提供了新的研究途徑，開(kāi)發(fā)新的診斷工具來(lái)檢測(cè)Wb是建立更有效的心絲蟲(chóng)診斷、治療和控制不良反應(yīng)的新方法。

目前Wb被報(bào)道的基因序列有wsp基因、過(guò)氧化氫酶基因、16S rRNA和沃爾巴克絲狀熱敏感蛋白基因(ftsZ基因)。ftsZ基因在沃爾巴克氏體中調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞分裂，有著保守的和高度分散的序列，可作為細(xì)菌分類(lèi)的基礎(chǔ)[4]。

本試驗(yàn)基于PCR和凝膠電泳的技術(shù)，擴(kuò)增犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體ftsZ基因，間接診斷犬的外周血的犬心絲蟲(chóng)感染，旨在探尋心絲蟲(chóng)病早期診斷技術(shù)，同時(shí)了解和證實(shí)海南省?？谑腥慕z蟲(chóng)的感染情況和犬心絲蟲(chóng)內(nèi)共生體Wb基因分型情況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 血樣采集來(lái)自與海南省小動(dòng)物流浪狗中心、海口市諾康寵物醫(yī)院和?？谑袠?lè)寵寵物醫(yī)院。

1.1.1 試劑 Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒，SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒。

1.1.2 儀器 離心機(jī)：上海手術(shù)器械廠(chǎng)生產(chǎn)；坩浴鍋；PCR儀；移液槍?zhuān)蛔贤夥治鰞x；瓊脂糖水平電泳儀；泡沫低溫箱。

1.2 血液DNA的提取 取50 μL的血液樣品加入到1.5 mL離心管中，再加入150 μL PBS使總體積為200 μL，混勻。加入20 μL Proteinase K，混勻。再加入200 μL的Buffer CL，震蕩混勻，56 ℃水浴 10 min。向上述離心管中加入200 μL的無(wú)水乙醇，充分顛倒混勻。將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2 min，再10 000 r/min(室溫)離心1 min，倒掉收集管中廢液。將吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500 μL CW1 Solution，10 000 r/min離心 30 s，倒掉廢液。將吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500 μL CW2 Solution，10 000 r/min離心30 s倒掉廢液。將吸附柱重新放回收集管中，于 12 000 r/min(室溫)離心2 min，離心去除殘留的CW2 Solution。將吸附柱蓋子打開(kāi)于室溫放置 5 min。取出吸附柱，加入一個(gè)新的1.5 mL離心管中，加入50 μL ddH2O靜置3 min，12 000 r/min(室溫)離心 2 min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即進(jìn)行下一步試驗(yàn)或-20 ℃保存。

1.3 目的基因PCR擴(kuò)增 采用PCR擴(kuò)增犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克絲狀熱敏感蛋白基因(ftsZ基因)，片段520～580 bp，擴(kuò)增引物參照國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的序列引物[8]。上游引物ftsZF為: 5′-ATAACAGCAGGAATGGGTGGT-3′; 下游引物ftsZR: 5′-TCACGCACTCTATTTGCTGCA-3′。PCR 反應(yīng)總體積為25 μL, 包括1 μL模板, 10.5 μL雙蒸水(ddH2O)，12.5 μL mix酶，1 μLftsZ基因引物。94 ℃ 變性4 min 進(jìn)入循環(huán), 94 ℃ 45 s, 52 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳, 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳, 溴化乙錠染色，于紫外燈下觀(guān)察。每次試驗(yàn)都設(shè)立空白(水)對(duì)照, 并采取嚴(yán)格措施以避免污染，出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，采用膠回收DNA 片段，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 序列測(cè)定與親緣性分析 PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序, 登錄美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI) 站點(diǎn)后，利用“Blast Sequence Similarity Searching”工具，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中注冊(cè)的ftsZ基因相關(guān)核苷酸序列(見(jiàn)表1)進(jìn)行同源性比較。用MEGA 3.1 軟件neighborjoining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

表1 用于ftsZ基因分析的相關(guān)序列

2 結(jié)果

2.1 基因擴(kuò)增結(jié)果及測(cè)序結(jié)果 共檢測(cè)犬血60份，犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體陽(yáng)性3份，陽(yáng)性率5.0%。測(cè)序結(jié)果目的片段長(zhǎng)度為544～560 bp。電泳圖見(jiàn)圖1。

圖1 陽(yáng)性標(biāo)本PCR擴(kuò)增電泳

注：M：DNA DL-2 000 的Marker； 1～3：陽(yáng)性樣本，其中1為haikou 1 hao，2為haikou 2 hao，3為chengdu 1 hao； 4：空白對(duì)照

2.2 基因親緣性分析結(jié)果 將犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體ftsZ基因序列與GenBank 中注冊(cè)的核苷酸序列進(jìn)行比較, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本次調(diào)查犬感染的犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體(Hainan 1hao)與GenBank中注冊(cè)的犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體(AY523519.1)的同源性最高。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)也顯示海南省犬感染的心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體與成都的犬感染的心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體聚在一個(gè)分支上, 而Dirofilariarepens、Dipetalonemagracile、Onchocercaochengi等都聚在外圍, 見(jiàn)圖2。序列分析表明, 本次調(diào)查的海南省?？谑腥腥镜奈譅柊涂耸象w均屬于D.immitis基因型而它們之間又并不是完全相同，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上雖然聚在一個(gè)大的分支上, 但在大分支上又有小的分支，而且遺傳距離各不相同。Hainan 1 hao 和成都發(fā)現(xiàn)的chengdu 1 hao基因型最近，而hainan 3 hao 與成都的基因型最遠(yuǎn)，并且hainan 1 hao 與hainan 3 hao 的基因型差距也較遠(yuǎn)。

圖2 基于犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克ftsZ基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

我國(guó)的犬心絲蟲(chóng)調(diào)查工作開(kāi)展較早，在我國(guó)的北京、上海、深圳、貴州、重慶、廣東、福建、浙江、湖南、四川、云南、山東、遼寧、內(nèi)蒙古和吉林等27個(gè)省和直轄市已有犬惡絲蟲(chóng)感染動(dòng)物的報(bào)道。但在海南開(kāi)展相關(guān)的工作卻較晚，2014年，賈麗欣首次用商品化的愛(ài)得士商品化膠體金免疫診斷試劑盒檢測(cè)到了海南8只犬感染了心絲蟲(chóng)病[5]。近年來(lái)，在犬惡絲蟲(chóng)病的診斷和防治研究上已取得了系列成果，免疫學(xué)如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)診斷技術(shù)近年來(lái)在本病的研究上不斷完善，具有高度特異性和敏感性，越來(lái)越多地被應(yīng)用于該病的臨床檢測(cè)。然而商品化診斷試劑盒卻存在以下問(wèn)題：對(duì)5個(gè)月齡以下的犬不易檢出；心臟寄生成蟲(chóng)少于5條時(shí)因血中抗體量較小，易出現(xiàn)假陰性；同時(shí), 在自然感染犬惡絲蟲(chóng)的犬中有10%～67% 為單性感染，不能產(chǎn)生微絲蚴，這些仍然是該診斷中的一個(gè)難點(diǎn)[6]。國(guó)內(nèi)外也有許多關(guān)于犬惡絲蟲(chóng)病檢測(cè)的其他方法的報(bào)道，如：有微絲蚴蟲(chóng)體檢測(cè)、皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、直接凝聚試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、熒光抗體標(biāo)記技術(shù)、PCR法等。目前診斷該病所采用的方法中，微絲蚴檢查法操作簡(jiǎn)單、容易判斷，但容易出現(xiàn)假陰性。皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、直接凝聚試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等方法操作復(fù)雜。

而PCR的檢測(cè)方法具有較高的靈敏性和特異性，在該病的診斷上具有良好的應(yīng)用前景。

沃爾巴克氏體是共生于犬惡絲蟲(chóng)體內(nèi)的共生菌，在絲蟲(chóng)發(fā)育的各個(gè)階段均存在，它誘導(dǎo)的免疫病理引起的炎癥反應(yīng)是絲蟲(chóng)感染后致病的主要原因之一[7]，當(dāng)犬惡絲蟲(chóng)死亡后，向機(jī)體釋放出大量的Wb會(huì)加劇犬的炎性反應(yīng)，在心絲蟲(chóng)病治療前減少沃爾巴克的水平有利于減少絲蟲(chóng)引起的不良病理反應(yīng)，故Wb為犬惡絲蟲(chóng)的致病機(jī)理以及診療提供了新的研究途徑，成為了治療犬惡絲蟲(chóng)病的靶位點(diǎn)[8]。開(kāi)發(fā)新的診斷工具來(lái)檢測(cè)Wb是建立更有效的心絲蟲(chóng)治療方案和控制不良反應(yīng)的新方法。

本試驗(yàn)在海南?？谑幸约胰疄閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物，在犬類(lèi)全血樣品中檢測(cè)到了犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體的沃爾巴克絲狀熱敏感蛋白基因(ftsZ基因)的特異核苷酸片段，從分子生物學(xué)的角度證實(shí)和發(fā)現(xiàn)了?？谑写嬖谌慕z蟲(chóng)沃爾巴克氏體及其基因型，認(rèn)為該地區(qū)為犬心絲蟲(chóng)病的潛在疫源地。并且犬感染心絲蟲(chóng)率高達(dá)5.0%，不僅反映出犬是海南省海口市犬心絲蟲(chóng)的重要宿主動(dòng)物之一，也說(shuō)明在犬心絲蟲(chóng)疫源地調(diào)查中利用犬作為指示動(dòng)物具有重要的價(jià)值和意義。

海南本地犬感染犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體雖然都屬于D.immitis基因型，但它們?cè)谙到y(tǒng)發(fā)育樹(shù)矩形框的距離之間仍存在著一定差異，反映了海南省海口市D.immitis型沃爾巴克氏體基因的多樣性較高。而我們本次試驗(yàn)采用的試驗(yàn)樣本均來(lái)自小動(dòng)物流浪狗中心和寵物醫(yī)院，說(shuō)明這些試驗(yàn)樣本極有可能受到比較復(fù)雜的環(huán)境因素影響，但是這是否確實(shí)與復(fù)雜的地理和氣候環(huán)境、宿主動(dòng)物等因素有關(guān)，或者它們?nèi)绾问苡绊懙模€有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。相對(duì)而言，它們與我國(guó)四川發(fā)現(xiàn)的D.immitis型較為接近。在進(jìn)化樹(shù)中，遺傳距離與地理分布間無(wú)明顯規(guī)律，可能由于沃爾巴克氏體的基因型比較復(fù)雜，媒介、宿主比較多樣，地理分布與基因型之間的關(guān)系需在今后的研究中繼續(xù)探索。

這些分子生物學(xué)的技術(shù)，可以對(duì)心絲蟲(chóng)的早期感染進(jìn)行診斷。而且，雖然大多數(shù)物種中都存在沃爾巴克氏體，但是隨著不斷進(jìn)化，寄主與沃爾巴克氏體的相互影響，沃爾巴克氏體漸漸進(jìn)化出許多個(gè)超群，通過(guò)研究不同物種中沃爾巴克氏體的基因親緣性關(guān)系，可以為治療絲蟲(chóng)病找到新的研究方向。

[1] 沈杰，黃兵.中國(guó)家畜家禽寄生蟲(chóng)名錄[M]. 北京: 中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，2004：110.

[2] 王中全，崔晶.惡絲蟲(chóng)病[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)(寄生蟲(chóng)病分冊(cè)), 2005,32(2): 53-60.

[3] 國(guó)升·一種新型的寄生蟲(chóng)病-犬惡絲蟲(chóng)病[J]．人人健康, 2012(19):29.

[4] Godelc，Kumars, KoutsovoulosG,etal．The genome of the heartworm,Dirofilaria immitis,reveals drug and vaccine targets[J]．Faseb J,2012,26(11):4 650-4 661.

[5] 賈麗欣,林德貴. 吡蟲(chóng)啉和莫西菌素混合滴劑對(duì)預(yù)防犬心絲蟲(chóng)的臨床效果[C].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)小動(dòng)物醫(yī)學(xué)分會(huì)第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)暨第一屆東北三省、內(nèi)蒙古、天津小動(dòng)物醫(yī)師大會(huì)論文集,大連.2014:82.

[6] Nagorny S A. Biological characteristics of the causative agent of dirofilariasis in dogs in the Rostov Region](Article in Russian)[J]. Med Parazitol(Mosk)，2009,3：7-10.

[7] 劉梅，楊光友.人和動(dòng)物絲蟲(chóng)共生菌-沃爾巴克氏體研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015.36(4):87-91.

[8] McCall J W, Genchi C,Kramer L,etal. Dzimianski, M T, Supakorndej, P,Mansour, A M, McCall, S D, Supakorndej, N, Grandi, G, Carson, B. Heartworm andWolbachia: therapeutic implications[J]. Veterinary Parasitology, 2008,158:204-214.

[9] William M. Parasitic Disease s of Wild M ammals [M]. 2nd ed. Manson: The Veterinary Press,2001: 460-536.