張繪艷 ， 羅通旺 ， 嚴(yán) 磊 ， 楊小康 ， 顧建紅 ， 袁 燕 ， 卞建春 ， 劉宗平 ， 劉學(xué)忠

(揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省動物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 揚州 225009)

聚ADP核糖聚合酶(PARP)是一類蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，主要存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞核中。PARP在DNA受損時被激活而且與DNA的損傷程度呈正相關(guān)，雖然PARP激活促進(jìn)了DNA的修復(fù)，但是過度的活化卻會引起細(xì)胞能量的耗竭最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[1]。目前人們發(fā)現(xiàn) PARP家族共有18位成員，而應(yīng)答DNA損傷的主要是PARP-1，占據(jù)PARP蛋白在細(xì)胞內(nèi)90%以上的活性[2]。根據(jù)文獻(xiàn)報道，近幾年發(fā)現(xiàn)一種新的細(xì)胞死亡方式Parthanatos就是由于PARP-1蛋白的過度表達(dá)所引起[3]。

Cd是一種有毒的重金屬，可以通過食物鏈進(jìn)入機(jī)體，攝入過量的Cd對機(jī)體的危害極其嚴(yán)重，會導(dǎo)致腎臟、肝臟、肺臟、骨骼等組織器官的損傷，對免疫系統(tǒng)也具有毒性效應(yīng)，嚴(yán)重危害了人體健康[4]。因此，很多實驗室對Cd的致病機(jī)理展開了研究，發(fā)現(xiàn)Cd可以導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激并激活多條凋亡通路[4-6]。腎臟是Cd最主要的蓄積部位，其毒性損傷尤為嚴(yán)重，近年來國內(nèi)外對Cd致腎臟損傷的研究常有報道[7]，但是Cd致腎臟損傷的潛在機(jī)制還不是很明確，因此本研究以大鼠腎小管上皮細(xì)胞系NRK-52E為模型，探究Cd致腎臟損傷的毒性機(jī)制以及PARP-1蛋白在此過程中發(fā)揮的作用，為進(jìn)一步揭示Cd對組織器官的毒性損傷機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 NRK-52E細(xì)胞系(上海中科院細(xì)胞庫)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國 Invitrogen公司)；RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒；線粒體膜電位檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒、BCA試劑盒(碧云天股份有限公司)；AO-EB雙染試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；兔抗PARP-1多克隆抗體(德國Santa Cruz 公司)；兔抗AIF多克隆抗體、兔抗β-actin單克隆抗體、兔抗Histone-H3單克隆抗體(美國CST公司)；醋酸鎘、NAC和DPQ(Sigma 公司)；實時無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀(RTCA SP; 美國艾森生物公司); TE 2000-U 倒置熒光顯微鏡(日本 Nikon公司)；酶標(biāo)儀(Tecan，Australia公司)；SG603A-HE型生物安全柜(美國Thermo公司)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(美國 Thermo公司)；電泳儀、電泳槽(美國Bio-Red公司)；Milli-Q Biocel型超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NRK-52E細(xì)胞系培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中(含有10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素)，放置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度下的二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好時進(jìn)行相關(guān)試驗。

1.2.2 RTCA技術(shù)分析Cd對細(xì)胞增殖的影響 RTCA技術(shù)是將微電極列陣整合在細(xì)胞培養(yǎng)板的每個細(xì)胞生長孔底部，可以實時、動態(tài)、定量的跟蹤細(xì)胞形態(tài)和增殖分化的改變并顯示在電腦上。試驗時首先向E-Plate檢測板中加入100 μL DMEM培養(yǎng)基并測定背景阻抗值。收集對數(shù)生長期細(xì)胞并計數(shù)，調(diào)整好細(xì)胞懸液濃度后向E-Plate檢測板中加入100 μL NRK-52E細(xì)胞懸液(約1×104個細(xì)胞)，將加入細(xì)胞的E-Plate檢測板放入培養(yǎng)箱中的檢測臺上，靜置30 min后開始實時動態(tài)的細(xì)胞增殖檢測。待細(xì)胞長到對數(shù)生長期時，將各培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基換成不含血清的培養(yǎng)基，用不同濃度的Cd處理或先用NAC預(yù)處理細(xì)胞30 min然后再進(jìn)行Cd孵育并繼續(xù)進(jìn)行實時動態(tài)檢測。

1.2.3 Western Blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 按照試劑盒說明書的步驟提取NRK-52E細(xì)胞的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白，各組取等量的蛋白樣品(20～40 μg)進(jìn)行SDS-PAGE電泳；將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，轉(zhuǎn)印完成后PVDF膜用5%脫脂奶粉溶液(TBST配制)室溫封閉90 min；加入一抗(1∶1 000稀釋)并放置于搖床上4 ℃孵育過夜；TBST洗滌6次，每次 5 min；洗完后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000稀釋)并常溫孵育2 h；再用TBST洗滌6次，每次5 min；顯影并用Image Lab軟件測定蛋白條帶的灰度并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)活性氧水平以及線粒體膜電位的變化 將細(xì)胞接種在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生長對數(shù)期時，將培養(yǎng)基更換成無血清的培養(yǎng)基并進(jìn)行分組，在對應(yīng)組中先用DPQ預(yù)處理細(xì)胞30 min然后進(jìn)行Cd孵育，孵育時間為12 h。用0.25%胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)ROS以及線粒體膜電位。

1.2.5 免疫熒光檢測線粒體膜電位 當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至生長對數(shù)期時，進(jìn)行分組并處理：對照組、陽性對照組、染Cd組(5 μmol/L孵育12 h)、Cd+NAC組(100 μmol/L NAC預(yù)處理30 min后用5 μmol/L Cd孵育12 h)、NAC組(100 μmol/L NAC孵育12 h)。孵育結(jié)束后按照試劑盒說明書裝載JC-1探針并利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照。在線粒體膜電位較低時JC-1以單體的形式存在并產(chǎn)生綠色熒光；在線粒體膜電位正常時JC-1以聚集物的形式存在，此時能夠檢測到紅色的熒光。

1.2.6 AO-EB試驗檢測細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時，設(shè)置組別并進(jìn)行處理：對照組、染Cd組(5 μmol/L孵育12 h)、Cd+NAC組(100 μmol/L NAC預(yù)處理30 min后用5 μmol/L Cd孵育12 h)、NAC組(100 μmol/L NAC孵育12 h)。孵育結(jié)束后按試劑盒說明書進(jìn)行染色并拍照。AO(吖啶橙)可以透過完整的細(xì)胞膜，與雙鏈DNA結(jié)合后使正常的細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的綠色熒光。凋亡早期的細(xì)胞其細(xì)胞膜完整而細(xì)胞核發(fā)生固縮，因此核染色質(zhì)會著綠色并呈固縮狀； EB(溴化乙錠)不能透過完整的細(xì)胞膜，所以正常的細(xì)胞不能被 EB 染色，只能透過細(xì)胞膜受損的細(xì)胞并與核DNA結(jié)合呈現(xiàn)橘紅色熒光；凋亡中期的細(xì)胞膜通透性增加，因此EB能夠進(jìn)入細(xì)胞核并與DNA 結(jié)合，呈現(xiàn)出鮮紅色，與 AO 同時染色后細(xì)胞會呈現(xiàn)橘色的熒光；凋亡末期的細(xì)胞由于細(xì)胞膜完整性遭到破壞，大量的EB進(jìn)入細(xì)胞核使紅色熒光強于綠色熒光，最終細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 蛋白條帶用ImageJ軟件分析灰度值，數(shù)據(jù)用Spass22統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。統(tǒng)計結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 Cd對NRK-52E細(xì)胞具有毒性作用并影響了細(xì)胞的增殖 利用實時細(xì)胞分析議檢測不同濃度的Cd對NRK-52E細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如中插彩版圖1所示。結(jié)果表明，在Cd孵育的早期，染Cd組的指數(shù)高于對照組，但隨著染Cd濃度和孵育時間的增加，細(xì)胞指數(shù)逐漸降低，在孵育5 h之后呈現(xiàn)明顯的時間依賴性和濃度依賴性。

圖1 鎘對細(xì)胞增殖的影響

2.2 Cd促進(jìn)PARP-1的表達(dá)以及細(xì)胞凋亡 我們用不同濃度的Cd處理細(xì)胞12 h，提取細(xì)胞蛋白并用Western Blot方法檢測PARP-1和AIF蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖2(A和B)所示。隨著染Cd濃度的增加，細(xì)胞漿以及細(xì)胞核中的PARP-1和AIF呈升高的趨勢，并且AIF的核轉(zhuǎn)位也具有濃度依賴性。另外，我們用PARP-1的特異性抑制劑DPQ干預(yù)Cd孵育的過程，然后用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡變化情況，結(jié)果如圖2(C和D)所示。結(jié)果顯示，與對照組相比，染Cd組的細(xì)胞凋亡率從11.05%升高到28.16%；加人DPQ干預(yù)后與Cd組比較，凋亡率降至18.07%；單獨加DPQ組的細(xì)胞凋亡率為12%。

圖2 PARP-1蛋白對細(xì)胞凋亡的影響

2.3 NAC在Cd對細(xì)胞增殖的影響中發(fā)揮了重要作用 我們用RTCA法檢測了抗氧化劑NAC對NRK-52E細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如中插彩版圖3所示。結(jié)果顯示，加入Cd處理后細(xì)胞的增值受到了明顯的影響，而在NAC干預(yù)組中其增值情況與Cd組相比有了明顯的改善；NAC單獨處理組對細(xì)胞增殖沒有明顯的影響。結(jié)果表明，Cd通過氧化應(yīng)激抑制了NRK-52E細(xì)胞的增殖。

圖3 NAC對細(xì)胞增殖的影響

2.4 氧化應(yīng)激與PARP-1蛋白在Cd致細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要的作用 為了進(jìn)一步揭示氧化應(yīng)激在這一過程中發(fā)揮的作用，我們利用免疫熒光的方法檢測了NAC對線粒體膜電位以及細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果如中插彩版圖4所示。經(jīng)過Cd處理后大部分細(xì)胞的線粒體膜電位散失，而加入100 μmol/L的NAC干預(yù)后線粒體膜電位明顯升高(見中插彩版圖4A)。而且對照組的細(xì)胞核著綠色熒光并呈正常結(jié)構(gòu)，染Cd組的細(xì)胞可見到大量的橘黃色熒光以及紅色熒光；Cd+NAC組中橘黃色熒光的細(xì)胞核減少，紅色熒光的細(xì)胞量也顯著下降：單獨加NAC組幾乎不見橘黃色或紅色熒光的細(xì)胞(見中插彩版圖4B)。另外，我們用PARP-1的特異性抑制劑處理細(xì)胞并檢測了線粒體膜電位以及細(xì)胞內(nèi)活性氧的變化情況，結(jié)果如圖5所示。與對照組比較，染Cd組中喪失線粒體膜電位的細(xì)胞比例明顯升高；加入DPQ處理后，處于異常線粒體膜電位的細(xì)胞比例明顯下降(圖5A)。細(xì)胞內(nèi)活性氧的測定結(jié)果顯示，抑制細(xì)胞內(nèi)PARP-1蛋白的活性后，ROS的含量由單獨染Cd組的12.8%降至5.29%。

圖4 NAC對線粒體膜電位和凋亡的影響 (200×)

A：NAC對線粒體膜電位的影響 ； B：AO-EB法檢測NAC對細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

在正常的細(xì)胞中PARP-1蛋白參與DNA損傷的修復(fù)，保持著基因組的穩(wěn)定性，但會消耗ATP，而在一些病理情況下，細(xì)胞的DNA大量損傷從而使PARP-1蛋白持續(xù)活化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NAD+和ATP大量消耗，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8]。此外，在經(jīng)典的細(xì)胞凋亡通路中，PARP-1作為Caspase-3和Caspase-7的切割底物參與了細(xì)胞的凋亡，并且通常把PARP蛋白的剪切認(rèn)為是細(xì)胞凋亡以及Caspase-3激活的一個重要指標(biāo)[9]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)PARP-1不僅作為底物參與細(xì)胞凋亡，而且當(dāng)PARP-1過度表達(dá)時還可以通過損傷線粒體并釋放出AIF和Endo G等誘發(fā)非Caspase依賴的細(xì)胞凋亡[10]，本研究中我們用Western Blot以及免疫熒光等方法也證實了這一結(jié)論。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體為了維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，由基因控制的自主性死亡。有研究表明，微摩爾級濃度的Cd即可以引起線粒體功能紊亂以及線粒體內(nèi)物質(zhì)的釋放[11]。當(dāng)線粒體膜電位下降時從線粒體釋放的蛋白分子主要有細(xì)胞色素C與AIF等，其中細(xì)胞色素C從線粒體釋放出來后引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)[12]，進(jìn)而引發(fā)Caspase依賴的細(xì)胞凋亡；AIF 蛋白是目前惟一確定的不依賴于Caspase家族就能夠降解DNA的線粒體下游分子[13]，從線粒體釋放出來后通過核轉(zhuǎn)位信號進(jìn)入細(xì)胞核引起非Caspase依賴的細(xì)胞凋亡。在研究中我們發(fā)現(xiàn)Cd促進(jìn)了PARP-1的表達(dá)，AIF的核轉(zhuǎn)位以及細(xì)胞凋亡(圖2)。氧化應(yīng)激是體內(nèi)ROS產(chǎn)生過多造成的一種負(fù)面影響，它可以通過線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及死亡受體等通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。正常的情況下機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除維持在一個平衡的狀態(tài)，因此對機(jī)體不造成損害，但是Cd暴露可以引起機(jī)體ROS的大量增加并破壞正常的氧化代謝反應(yīng)，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激[14]。另外，氧化應(yīng)激可以引起細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的改變，而膜電位的下降被認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期事件。在本研究中我們也檢測了抗氧化劑NAC對細(xì)胞增殖，線粒體膜電位以及細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在Cd致NRK-52E細(xì)胞的損傷中發(fā)揮了重要的作用。

圖5 PARP-1蛋白對線粒體膜電位以及細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響

RTCA技術(shù)近年來被廣泛的應(yīng)用于臨床實驗研究[15]，本文中我們也用RTCA的方法驗證了Cd對細(xì)胞的毒性作用。另外Western Blot結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明，在這一過程中PARP-1蛋白的大量表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。但是在Cd孵育的細(xì)胞中抑制PARP-1的活性并不能完全阻止細(xì)胞凋亡，這是因為除了與PARP-1蛋白相關(guān)的通路外還有其他凋亡途徑也參與了Cd致細(xì)胞的損傷過程。在正常的細(xì)胞中抑制PARP-1的活性后由于阻止了PARP-1對DNA的修復(fù)，因此在一定程度上起到了促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。此外，在研究中我們發(fā)現(xiàn)用NAC處理細(xì)胞可以降低Cd導(dǎo)致的線粒體損傷和細(xì)胞凋亡，而且用DPQ處理細(xì)胞時也減弱了Cd對線粒體膜電位以及細(xì)胞內(nèi)ROS的影響。以上結(jié)果表明，Cd能夠抑制NRK-52E細(xì)胞的增殖并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而氧化應(yīng)激與PARP-1蛋白在這一過程中發(fā)揮了重要作用。

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