羅秋水++周志娥++湯凱潔++李奔++劉鵬飛

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.098

摘要：為研究并優(yōu)化野生魚腥草甲醇提取工藝及其體外抗氧化能力，在單因素試驗的基礎上設計正交試驗，通過方差分析、多重比較確定最優(yōu)提取工藝。用羥基自由基（·OH）的清除作用、總抗氧化能力、1，1-二苯基-2-苯基自由基（DPPH·）清除作用及清除亞硝酸鹽（NO-2）能力的測定方法評價甲醇提取物體外抗氧化活性。結果表明：最佳提取工藝條件為料液比1 g ∶35 mL、提取時間1.0 h、提取溫度80 ℃、甲醇體積分數(shù)70%；甲醇提取物在0～1 mg/mL濃度范圍具有明顯的抗氧化活性，并且隨著濃度的增大，活性增強；當甲醇提取物的濃度為1 mg/mL時，其對羥基自由基的清除率達到50.23%，對DPPH·的清除率達78.86%，對亞硝酸鹽的清除率高達8724%；與對照品維生素C相比，提取物的總抗氧化能力與其接近。因此可知，野生魚腥草甲醇提取物具有明顯體外抗氧化活性。

關鍵詞：野生魚腥草；甲醇提取物；提取工藝；抗氧化活性

中圖分類號：R284.2文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2016）10-0337-03

收稿日期：2015-09-11

基金項目：國家自然科學基金（編號：31101294）。

作者簡介：羅秋水（1977—），男，江西樟樹人，碩士，實驗師，從事食品質量與安全研究。E-mail：lqsh2001@126.com。

通信作者：湯凱潔，博士，副教授，從事食品質量與安全研究。E-mail：tkjie999@sina.com。魚腥草（Houttuyniae）別稱紫蕺、野花麥、折耳根等，主要分布于中國中部、東南及西南部各省（區(qū)），以長江以南各省份為主，包括川、鄂、贛、湘、黔等省[1]。魚腥草在民間傳統(tǒng)中醫(yī)上具有一定的藥用價值[2]，其中所含的功效成分包括黃酮類化合物、揮發(fā)性物質、多糖等，其中黃酮類化合物包括榭皮素、榭皮苷、瑞諾苷、蕓香苷等[3]。在現(xiàn)代醫(yī)學中，魚腥草廣泛應用于治療肺膿瘍、痰熱咳嗽、尿路感染等。魚腥草的主要抗菌成分是魚腥草素，對各種致病菌、流感病毒等有抑制作用[4-6]，特別是對金黃色葡萄球菌抑制作用非常明顯。近年來又發(fā)現(xiàn)魚腥草有新的用途，如治療喘息型肺炎，此外對病毒性心肌炎、小兒呼吸感染均有療效。目前，隨著醫(yī)學領域對魚腥草研究的深入，魚腥草化學成分的作用機理更加清晰，藥用價值及食用價值已被越來越多的人重視。魚腥草兼具食品保健功能特性，生物活性成分較高，與西藥相比具有特殊醫(yī)藥功效[7]，因此魚腥草的藥用價值、食用價值的前景將十分可觀。本研究通過魚腥草甲醇提取物的體外抗氧化活性試驗，以期為野生魚腥草的進一步充分利用提供參考和借鑒。

1材料與方法

1.1材料與試劑

野生魚腥草采摘于江西農業(yè)大學校內。鄰菲羅啉，天津永大化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-苯基自由基（DPPH·），北京中生瑞泰科技有限公司；維生素C、無水乙醇、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、雙氧水、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、氫氧化鈉、濃硫酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、檸檬酸、草酸、磷酸鈉、氨基苯磺酸鈉，均為國產分析純。

1.2儀器與設備

723可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；BS224S 電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；DZG-6020真空干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；移液器，Thermos；SB-3200DTD超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV752紫外-可見分光光度計，上海諾科儀器儀表有限公司；DHG-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；XY-200高速多功能粉碎機，浙江省永康市松青五金工具廠；TCL5M臺式低速大容量冷凍離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司。

1.3野生魚腥草甲醇提取工藝優(yōu)化

1.3.1單因素試驗設計稱取1.0 g魚腥草粉末，以甲醇體積分數(shù)60%、料液比1 g ∶mL、提取溫度70 ℃、提取時間1 h為單因素試驗的基礎條件。當研究某一因素時，使其他條件保持不變。甲醇體積分數(shù)分別設為50%、60%、70%、80%、90%，料液比分別設為1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶35 mL、1 g ∶40 mL，提取時間分別設為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，提取溫度分別設為50、60、70、80、90 ℃。按上述設計分別做單因素不同水平的試驗，所得提取物在電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干，按照下面公式計算提取物得率：

提取物得率=（m2-m1）/m0×100%。

式中：m2為空瓶+提取物質量，g；m1為空瓶質量，g；m0為樣品質量，g。

1.3.2正交試驗設計為了綜合考慮各因素對野生魚腥草甲醇提取物得率的影響，根據(jù)上述單因素試驗結果，選取甲醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、提取溫度4個因素，采用 L9（34） 正交設計對野生魚腥草甲醇提取條件進行優(yōu)化，正交試驗因素水平詳見表1。

1.4野生魚腥草甲醇提取物的測定

1.4.1野生魚腥草甲醇提取物的制備及提取得率計算將野生魚腥草清除黃葉、洗凈、烘干、剪碎、粉碎后放入干燥器中

1.4.2甲醇提取物濃度和對照品維生素C的配制準確稱取0.500 g甲醇提取物，配制成濃度為1 000 μg/mL的樣品溶液，并以此為基準，逐步稀釋配制200、400、600、800、1 000 μg/mL 的樣品溶液。按同樣方法配制同樣系列濃度梯度的維生素C標準液，將二者存儲于冰箱備用。

1.4.3對羥基自由基（·OH）的清除作用參考鄰二氮菲-金屬離子-H2O2[8]，同時采用Fenton反應（H2O2+Fe2+→·OH+H2O+Fe3+）獲得羥基自由基，反應過程中將鄰二氮菲-Fe2+氧化為鄰二氮菲-Fe3+，通過全波長掃描發(fā)現(xiàn)，在 510 nm 處最大吸收峰消失，從而可以在510 nm處測其吸光度，通過測定樣品在該波長處的吸光度可判斷羥基自由基存在的量，并以此計算羥基自由基清除率。具體方法：（1）取磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH值=7.4）2.0 mL于試管中并加入8.0 mL蒸餾水，搖勻作為空白管；（2）取2.0 mL磷酸鹽緩沖液、1.5 mL 5 mmol/L鄰二氮菲、1.0 mL 7.5 mmol/L硫酸亞鐵和5.5 mL蒸餾水于試管中，搖勻作為未損傷管A；（3）以A管為基準，在此基礎上加入0.1% H2O2 1.0 mL、蒸餾水 4.5 mL，搖勻作損傷管并標記為B；（4）以B管為基準，在該基礎上分別加入1.0 mL各樣品溶液，搖勻后作為樣品管并標記為C；（5）將上述所有試管混勻后置于37 ℃恒溫水鍋中保溫30 min，然后取出并定容到10 mL，在波長510 nm處測定吸光度。根據(jù)以下公式計算各個濃度對羥基自由基清除率：

·OH清除率=[（DC-DB）/（DA-DB）]×100%。（1）

1.4.4清除亞硝酸鹽（NO-2）的能力[9-10]分別取3 mL各濃度的樣液加入到具塞試管中，用檸檬酸緩沖液（pH值=3.0）定容至5 mL。分別向每支管中加入0.1 mL亞硝酸鈉（200 μg/mL），混勻后立即置于37 ℃恒溫水浴鍋中保溫 1.5 h。同時，空白管不加亞硝酸鈉；亞硝酸鈉標準管不加亞硝酸鈉及樣品，其余相同。通過鹽酸萘乙二胺比色法[11]測定各管的吸光度（D540 nm）。根據(jù)以下公式計算各個濃度對亞硝酸鹽（NO-2）的清除率：

NaNO2清除率= [D標-（D樣-D空）]/D標×100%。（2）

1.4.5清除DPPH·的清除作用[12]甲醇提取物清除DPPH·能力的測定：取10 mg DPPH標準品，用95%乙醇為溶劑配制質量分數(shù)為10%的溶液；各取1 mL甲醇提取物樣液于試管中，然后迅速加入3 mL配制好的DPPH乙醇溶液，快速搖勻并且置于室溫陰暗處反應30 min；然后將反應后各管迅速取出并在波長為517 nm處測定吸光度（Da）；同時按上述比例分別測定溶劑與DPPH混合后的吸光度（Dc）、試劑與樣液混合后的吸光度（Db）。按下式計算DPPH·清除率：

DPPH·清除率=[1-（Da-Db）/Dc]×100%。（3）

1.4.6總抗氧化力各取0.4 mL不同濃度的魚腥草甲醇提取液加入試管中，然后依次加入28 mmol/L磷酸鈉、0.6 mol/L 硫酸、4 mmol/L鉬酸銨，各4 mL，混勻后并置于 95 ℃ 恒溫水浴鍋中90 min，然后冷卻至室溫并在波長 695 nm 處測其吸光度；以蒸餾水組作為空白管，所有測定均做3次平行試驗[13]。

2結果與分析

2.1單因素試驗結果

當提取時間為0.5～1.5 h時，甲醇提取物得率增加速度較快；當提取時間1.5～2.5 h時，甲醇提取物得率變化趨勢有增有減。從節(jié)省時間來考慮，選取提取時間為1.0、1.5、2.0 h 做正交試驗。當乙醇體積分數(shù)為70%時，甲醇提取物得率最大，之后得率明顯下降。從提取效果、減少溶劑用量考慮，分別選擇乙醇體積分數(shù)為60%、70%、80%做正交試驗。當提取溫度為40～50 ℃時，甲醇提取物濃度較快增加至最大值，之后甲醇提取物濃度先降低再升高。從經濟角度考慮，選取溫度70、80、90 ℃做正交試驗。甲醇提取物得率隨料液比增加一直增大，在料液比為1 g ∶30 mL后增大緩慢。從提取效果和減少溶劑用量角度考慮，分別選擇料液比為 1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶35 mL做正交試驗。

2.2正交試驗結果、方差分析及多重比較

由表2正交設計試驗可知，通過極值R大小得出各因素對提取物提取得率影響大小依次為料液比>甲醇體積分數(shù)>提取時間>提取溫度。由表3方差分析可知，料液比、甲醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度4個因素對提取物提取率的影響都極顯著。由表4多重比較得出，最佳提取工藝為A3B1C2D2、A3B3C2D2。通過驗證試驗，得出A3B1C2D2提取率最大，比正交表中的任何值還大，所以選擇最佳提取工藝條件為A3B1C2D2，此時提取得率為19.13%。

2.3對羥基自由基的清除作用

由圖1可知，甲醇提取物對羥基自由基的清除作用隨著濃度增加逐漸增大；當濃度在0～600 μg/mL范圍內， 清除率呈直線增加；當濃度在600～800 μg/mL時，其清除率明顯加快；之后的清除率略有增加但趨勢變緩，在1 000 μg/mL濃度下維生素C對羥基自由基清除率達到75.49%，而樣品清除率為50.23%。

2.4總抗氧化能力

自由基含有1個不成對的電子原子團，在形成分子時，自由基就會奪取其他物質的1個電子， 從而使自己變得更加穩(wěn)定，這種現(xiàn)象稱為氧化[14]。由圖2可以看出，魚腥草甲醇提取物D695 nm在濃度0～1000μg/mL范圍內隨濃度增大而提高，其總抗氧化能與維生素C基本平行增大且接近。

2.5對DPPH·的清除作用

DPPH·乙醇溶液呈紫色，最大吸收波長為517 nm。當加入自由基清除劑到DPPH溶液中時，其孤電子成對，吸收消失或減弱，從而使溶液顏色變淺，并在517 nm處的吸光度變化趨勢與自由基清除率呈線性相關。因此，該法可以用來檢測某種物質對自由基的清除能力，清除率越大則證明其清除自由基能力越強。由圖3可以看出，甲醇提取物對DPPH·清除率在0～1 000 μg/mL范圍內一直增大，當濃度為 1 000 μg/mL 時，清除率達78.86%；對照品維生素C對 DPPH· 清除率與甲醇提取物趨勢基本相同，但相比之下后者的清除效果更好，在1 000 μg/mL時清除率高達92.78%。

2.6清除亞硝酸鹽（NO-2）的能力亞硝胺類物質能引起諸多慢性或惡性腫瘤。雖然在正常情況下，人們直接攝入該類致癌物的量幾乎可以忽略，但食物中可形成N-亞硝胺類的前體物質卻大量存在，其中亞硝酸鹽是能夠形成N-亞硝胺類的前體物質[15]。由圖4可以看出，在0～200 μg/mL范圍內，維生素C對亞硝酸的清除能力均隨著濃度的增加迅速增大，之后增加比較平緩；當濃度升高到1 000 μg/mL時，清除率達到96.75%；甲醇提取物的濃度在0～200 μg/mL時清除亞硝酸的能力先增大后基本保持不變；但是當濃度達到600 μg/mL后，其清除能力又迅速增大，并且在1 000 μg/mL時清除率高達87.24%。

3結論

根據(jù)單因素試驗結果，采用L9（34）正交試驗對提取物的提取工藝進行優(yōu)化設計，料液比、甲醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度對提取物得率影響均差異極顯著。各因素對提取物得率影響排序為料液比>甲醇體積分數(shù)>提取時間>提取溫

度。通過方差分析和多重比較后進行驗證試驗，可知最佳工藝參數(shù)：料液比為1 g ∶35 mL、提取時間為1.0 h、提取溫度為 80 ℃、甲醇濃度為70%，此時提取得率為19.13%。

甲醇提取物在0～1 000 μg/mL濃度范圍內有較明顯的抗氧化活性，各指標活性隨著濃度的增加而增強；當甲醇提取物的濃度為1 000 μg/mL時，甲醇提取物對羥基自由基清除率為50.23%，對1，1-二苯基-2-苯基自由基的清除率達到78.86%，對亞硝酸鹽（NO-2）的清除率高達87.24%；甲醇提取物的總抗氧化能力和濃度呈正相關，與對照品維生素C相比，總抗氧化力變化趨勢基本接近。

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