鄺良德++任永軍++謝曉紅++雷岷++郭志強(qiáng)++李叢艷++鄭潔++張翔宇++張翠霞++楊超++鄧小東

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.078

摘要：為研究飼糧不同纖維水平對初產(chǎn)母兔血清中瘦素含量以及卵巢組織中OB、OB-R基因表達(dá)的影響，選取165日齡的新西蘭青年母兔240只，隨機(jī)分為4個(gè)處理，分別為12%、14%、16%、18%纖維水平添加組，每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只，每個(gè)處理共60只。結(jié)果顯示，從配種到分娩，各處理組的母兔血清中瘦素含量均呈上升趨勢。不同處理組相比較，母兔血清中瘦素含量存在顯著差異，其中16%添加組的母兔血清瘦素含量最高?；虮磉_(dá)研究表明，16%添加組的母兔卵巢中，OB、OB-R基因的表達(dá)量顯著高于其他各試驗(yàn)組。飼糧不同纖維水平對初產(chǎn)母兔瘦素分泌影響顯著，初產(chǎn)母兔飼糧中纖維的適宜添加水平為16%。

關(guān)鍵詞：纖維；母兔；OB基因；OB-R基因；卵巢；基因表達(dá)

中圖分類號： S829.15文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0281-03

收稿日期：2016-04-08

基金項(xiàng)目：四川省公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（編號：SASA2015A10）；四川省“十二五”畜禽育種攻關(guān)項(xiàng)目（編號：2011NZ0099）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（編號：201303143-5）；國家兔產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（編號：CARS-44-B-4）；動物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行補(bǔ)助項(xiàng)目。

作者簡介：鄺良德（1983—），男，湖南郴州人，碩士，助理研究員，主要從事家兔遺傳育種及飼養(yǎng)研究。E-mail：happyboy5851258@163.com。

通信作者：任永軍，碩士，助理研究員，主要從事家兔飼養(yǎng)及疫病防控研究。E-mail：360167513@qq.com。粗纖維泛指植物性來源纖維成分，包括纖維素、半纖維素、果膠、植物膠、黏多糖、木質(zhì)素等，主要存在于植物的細(xì)胞壁中。國內(nèi)外研究表明，粗纖維是家兔最重要的營養(yǎng)素之一，對家兔具有特殊的生理作用，在構(gòu)成合理日糧結(jié)構(gòu)、維持家兔正常生理功能、初產(chǎn)母兔繁殖及胚胎成活率等方面起著極為重要的作用。瘦素（leptin）是肥胖基因（obesegene，ob）編碼的產(chǎn)物，是一種分泌性蛋白質(zhì)類激素。OB基因是1條含167個(gè)氨基酸密碼的DNA序列，包含有2個(gè)外顯子、1個(gè)內(nèi)含子。Hindlet等研究發(fā)現(xiàn)，缺陷ob/ob（缺乏功能性瘦素）雌鼠不僅表現(xiàn)出肥胖，還出現(xiàn)生殖功能障礙，持續(xù)注射外源性瘦素后可恢復(fù)生殖功能，由此證明瘦素與生殖功能有關(guān)[1-2]。瘦素受體由db基因（diabetes gene）編碼，為高度特異的跨膜蛋白質(zhì)，與瘦素具有高度親和力。最初認(rèn)為瘦素只在白色脂肪組織中表達(dá)，之后研究發(fā)現(xiàn)，瘦素在下丘腦、垂體、肺、胃底部上皮、骨骼肌、卵巢、子宮內(nèi)膜、合體滋養(yǎng)層細(xì)胞、乳腺上皮等均有表達(dá)，且在卵巢、子宮內(nèi)膜中與瘦素受體同時(shí)表達(dá)[3-4]。

瘦素及其受體在下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸的多處表達(dá)，表明瘦素對生殖的調(diào)節(jié)是通過旁分泌或內(nèi)分泌方式對HPG軸不同水平進(jìn)行復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)節(jié)，從而對哺乳動物的繁殖機(jī)能發(fā)揮重要作用[5-7]。適宜的粗纖維水平對家兔繁殖生產(chǎn)具有重要意義；因此，通過深入研究不同粗纖維水平對初產(chǎn)母兔瘦素分泌及其基因表達(dá)的影響，為降低母兔淘汰率、死亡率，綜合提高母兔繁殖性能提供前提條件和基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)及母兔飼養(yǎng)管理

選擇相同日齡（165日齡）的新西蘭青年母兔240只，隨機(jī)分為4個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只，每個(gè)處理共60只。試驗(yàn)期為母兔165日齡至第1胎分娩，4個(gè)處理分別飼喂12%、14%、16%、18%水平纖維的日糧，所有日糧均按美國NRC肉兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制。分別于母兔配種當(dāng)天、妊娠21 d、分娩當(dāng)天從每個(gè)重復(fù)中選擇4只母兔，每個(gè)處理共20只，進(jìn)行耳緣靜脈采血，分離血清并于-20 ℃保存待測。同時(shí)，在以上日齡的每個(gè)重復(fù)中選擇1只母兔，每個(gè)處理5只，共計(jì)60只，進(jìn)行屠宰并采集卵巢組織樣品，于-80 ℃保存，用于瘦素及瘦素受體mRNA表達(dá)量的測定。

1.2試驗(yàn)日糧及營養(yǎng)水平

按照美國NRC肉兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制全價(jià)料，試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。在日糧中添加苜蓿草粉，將日糧粗纖維水平分別調(diào)整為12%、14%、16%、18%，即試驗(yàn)1、2、3、4組。所有試驗(yàn)?zāi)竿镁曫B(yǎng)在同一兔舍內(nèi)，自由采食、自動飲水。

1.3主要儀器及試劑

Biowave DNA型核酸蛋白檢測儀，Power Pac 3000型電泳儀，島津UV2600型紫外分光光度計(jì)，Polytron PT1200E型電動勻漿器，Bio-rad iCycler iQ型定量PCR儀，日立CR22g型高速冷凍離心機(jī)，Versa Doc 1000型凝膠成像系統(tǒng)，無菌操作工作臺。兔瘦素（leptin）ELISA測定試劑盒為基因美公司產(chǎn)品，Trizol試劑、PrimeScriptTM RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM均為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.4試驗(yàn)指標(biāo)測定

1.4.1血清瘦素水平測定分別取-20 ℃冰箱中冷凍保存的血清樣品，每個(gè)樣品取0.5 mL進(jìn)行瘦素水平測定。血清瘦素的測定采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），利用紫外分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）進(jìn)行讀數(shù)。

1.4.2瘦素及瘦素受體基因mRNA表達(dá)量的測定采用Trizol法提取各組織樣品中的總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA的質(zhì)量和完整性，將質(zhì)量合格的RNA置于 -80 ℃ 冰箱中凍存?zhèn)溆?。參照PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于 -20 ℃ 保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank公布的家兔瘦素基因（OB）、瘦素受體基因（OB-R）、內(nèi)參基因GAPDH序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增OB、OB-R、GAPDH基因。所有引物均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，引物序列及參數(shù)見表2。以GAPDH為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測OB、OB-R基因在初產(chǎn)母兔卵巢組織中mRNA表達(dá)量的變化規(guī)律。RT-PCR體系（20 μL）為：1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μL SYBR Premix Ex TaqTM（2×）、10 μmol/L的上下游引物各0.6 μL、7.8 μL超純水。采用iCycler型熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）進(jìn)行擴(kuò)增，PCR條件為：95 ℃ 90 s；95 ℃ 15 s，63 ℃ 20 s，42個(gè)循環(huán)；72 ℃ 15 s。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行樣。所得到的CT值（cycle threshold）采用2-ΔΔCT方法[8]計(jì)算。目的基因mRNA表達(dá)水平通過內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行校正。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncans檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較和顯著分析。所有數(shù)據(jù)均為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”，顯著性水平為P<0.05，極顯著水平為P<0.01。

2結(jié)果與分析

2.1纖維水平對初產(chǎn)母兔瘦素分泌的影響

由表3可知，配種當(dāng)天各處理組母兔血清中的瘦素含量存在差異，其中試驗(yàn)3組瘦素含量最高，顯著高于其他試驗(yàn)組（P<0.05），試驗(yàn)1、2組顯著高于試驗(yàn)4組（P<0.05）。在妊娠21 d，試驗(yàn)3組瘦素含量最高，顯著高于試驗(yàn)1、4組（P<0.05），試驗(yàn)1組與試驗(yàn)4組之間差異不顯著。在分娩當(dāng)天，試驗(yàn)3組瘦素含量顯著高于其他各試驗(yàn)組（P<0.05），試驗(yàn)1組與試驗(yàn)4組之間差異不顯著，試驗(yàn)1組瘦素含量最低。從配種到分娩，各處理組母兔血清中的瘦素含量均呈上升趨勢。

2.2纖維水平對初產(chǎn)母兔卵巢組織中OB基因表達(dá)的影響

由表4可知，配種當(dāng)天各處理組母兔卵巢組織中的OB基因表達(dá)量存在顯著差異，其中試驗(yàn)3組OB基因表達(dá)量最高，顯著高于其他各試驗(yàn)組（P<0.05），試驗(yàn)4組表達(dá)量最低，試驗(yàn)1組與試驗(yàn)2組之間差異不顯著。在妊娠21 d，試驗(yàn)3組OB基因表達(dá)量最高，表達(dá)量依次為試驗(yàn)3組>試驗(yàn)1組>試驗(yàn)2組>試驗(yàn)4組。在分娩當(dāng)天，試驗(yàn)3組OB基因表達(dá)量顯著高于其他各試驗(yàn)組（P<0.05），試驗(yàn)1組與試驗(yàn)4組之間差異不顯著。從配種到分娩，各處理組母兔卵巢組織中的OB基因表達(dá)量均呈顯著上升趨勢。

2.3纖維水平對初產(chǎn)母兔卵巢組織中OB-R基因表達(dá)的影響

由表5可知，飼料中纖維水平對初產(chǎn)母兔卵巢組織中的OB-R基因表達(dá)有顯著影響。在配種當(dāng)天， 各處理組母兔卵巢組織中的OB-R基因表達(dá)量存在差異，其中試驗(yàn)3組 OB-R基因表達(dá)量最高，顯著高于其他各試驗(yàn)組（P<0.05）。在妊娠21 d，試驗(yàn)3組OB-R基因表達(dá)量最高，顯著高于其他各試驗(yàn)組（P<0.05），試驗(yàn)4組表達(dá)量最低。在分娩當(dāng)天，試驗(yàn)3組OB-R基因表達(dá)量顯著高于其他各試驗(yàn)組（P<0.05），表達(dá)量依次為試驗(yàn)3組>試驗(yàn)2組>試驗(yàn)4組>試驗(yàn)1組。從配種到分娩，試驗(yàn)2、3、4組母兔卵巢組織中的OB-R 基因表達(dá)量均呈顯著上升趨勢，試驗(yàn)1組則表現(xiàn)為先升高、后基本維持不變。

3結(jié)論與討論

作為分泌性蛋白質(zhì)類激素，瘦素通過與其受體發(fā)生特異性結(jié)合來發(fā)揮作用。瘦素水平呈生理性波動，卵泡早期瘦素水平較低，于排卵期達(dá)到高峰。瘦素可激活磷酸二酯酶水解第二信使cAMP，刺激胚泡的分裂，從而導(dǎo)致卵細(xì)胞的成熟[9-10]。已有研究表明，瘦素可促進(jìn)卵泡刺激素（FSH）、促黃體激素（LH）、雌二醇（E2）的產(chǎn)生，影響卵巢的生殖能力，體內(nèi)瘦素水平過低將導(dǎo)致女性不孕。Barashi等每天給小鼠注射瘦素，發(fā)現(xiàn)小鼠的LH、FSH水平明顯升高，表明瘦素可在一定程度上提高動物卵巢的生殖功能；小鼠在瘦素水平極低的情況下出現(xiàn)不孕癥現(xiàn)象，而注射瘦素后生育功能得到改善[11-12]。為禁食蛋雞注射外源瘦素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在禁食期間注射瘦素可抑制卵泡的衰亡，蛋雞產(chǎn)蛋行為的停止被延遲，由此可見瘦素具有抑制卵巢功能退化、提高雞繁殖性能的作用[13-14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，從配種到分娩，各處理組母兔血清中的瘦素含量均呈上升趨勢，這與母兔卵巢組織中OB、OB-R基因表達(dá)量基本符合。不同纖維水平添加組之間相比較，母兔血清中的瘦素含量存在顯著差異。在各試驗(yàn)階段，試驗(yàn)3組母兔血清中的瘦素含量均最高。在基因表達(dá)方面，試驗(yàn)3組母兔卵巢中的OB、OB-R基因表達(dá)量顯著高于其他各試驗(yàn)組。飼糧不同纖維水平對初產(chǎn)母兔瘦素分泌影響顯著，初產(chǎn)母兔飼糧中纖維的適宜添加水平為16%。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hindlet P，Bado A，F(xiàn)arinotti R，et al. Long-term effect of leptin on coupled peptide cotransporter 1 activity and expression in vivo：evidence in leptin-deficient mice[J]. J Phacmacol ExpTher，2007，323（1）：192-201.

[2]Tartaglial A，Dembski M，Weng，et al. Identification and expression cloning of a leptin receptor OB-R[J]. Cell，1995，83：1263-1270.

[3]Ferguson E M，Slevin J，Ashworth C J，et al. Effect of alterations in the quantity and composition of the pre-mating diet on embryo survival and foetal growth in the pig[J]. Animal ReProduetion Seienee，2006，96：89-103.

[4]羅啟慧，唐秀瑩，陳正禮，等.大熊貓胃腸道神經(jīng)肽Y和長型瘦素受體的表達(dá)[J]. 生物工程學(xué)報(bào)， 2015，31（8）：1175-1183.

[5]李駿，鄭鴻培，侯蓉. Leptin在動物繁殖上的研究進(jìn)展[J]. 黑龍江動物繁殖，2005，13（1）：16-18.

[6]Myers M G. Leptin receptor signaling and the regulation of mammalian physiology[J]. Recent Progress in Hormone Research，2004，59：287-304.

[7]Seroussi E，Cinnamon Y，Yosefi S，et al. Identification of the Long-Sought leptin in chicken and duck：expression pattern of the highly GC-Rich avian leptin Fits an autocrine/paracrine rather than endocrine function[J]. Endocrinology，2016，157（2）：737-751.

[8]Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods，2001，25：402-408.

[9]楊靜，楊琳. 瘦素對繁殖的影響[J]. 廣東飼料，2013，22（7）：25-26.

[10]張楠楠，白康，陳輝，等. 外源瘦素對蛋雞能量代謝及OB-R基因表達(dá)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（8）：198-201.

[11]Barashi A，Chung C C，Weigle D S，et al. Leptin is a metabolic signalto the repoductive system[J]. Endocrinology，1996，137（7）：3144-3147.

[12]Chan J L，Mantzoros C S. Role of leptin in energy deprivation states：normal human physiology and clinical implications for hypothalamic amenorrhoea and anorexia nervosa[J]. Lancet，2005，366（9479）：74-85.

[13]Leroy T，Vranken E，van Brecht A，et al. A computer vision method for on-line behavioral quantification of individually caged poultry[J]. Transactions of the ASABE，2006，49（3）：795-802.

[14]Paczoska E H E，Gertler A，Proszkowiec M，et al. Attenuation by leptin of the effects of fasting on ovarian function in hens[J]. Reproduntion，2003，126（6）：739-751.