林德勝 練惠輝 黃建春

KingFisher核酸提取儀在疑難檢材中的應(yīng)用

林德勝 練惠輝 黃建春

福建省公安廳刑事技術(shù)總隊

：探討KingFisher核酸提取儀的應(yīng)用價值。：通過對不同檢材的提取純化，對比KingFisher核酸提取儀和4種提取純化方法的提取效果。：KingFisher具有高效的純化效果。

法醫(yī)物證 提取純化 KingFisher

DNA在案件偵破過程中發(fā)揮的作用越來越重要。近年來，檢材量逐年上升，特別是以接觸性檢材為主的疑難物證數(shù)量呈爆發(fā)態(tài)勢增長。傳統(tǒng)的手工提取方法工作量大、操作復(fù)雜、易污染、容易受技術(shù)手法和操作經(jīng)驗的影響，而采用自動化核酸提取儀可以提供一種穩(wěn)定的實驗方案，同時減輕實驗人員的負擔(dān)。

本研究采用Thermo公司的KingFisher核酸提取儀，對比幾種常見的DNA提取純化方法，初步評估KingFisher核酸提取儀的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本

測試樣本：用脫落細胞粘取器粘取指紋9個。

案件樣本：案件中各類檢材37個，其中鞋帽手套22個，刀柄2把，煙頭13個。

建庫樣本：陳舊疑難血樣6份。

1.2 儀器和試劑

1.2.1儀器

KingFisher核酸提取儀（Thermo公司，美國）、EZ1快速核酸提取儀（QIAGEN公司，德國）、9700擴增儀（AB公司，美國）、ABI-3500XL遺傳分析儀（AB公司，美國）。

1.2.2試劑

ML-超微量磁珠法DNA提取試劑盒（長春博坤公司，中國）、EZ1?DNA Investigator試劑盒（QIAGEN，德國）、MagAttract?M48 DNA Manual試劑盒（QIAGEN，德國），QIAquick?PCR Purification試劑盒（QIAGEN，德國），Identifiler?Plus試劑盒（AB公司，美國），ID-Direct試劑盒（AB公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1樣本處理

測試樣本：將粘取好樣本的脫落細胞粘取器膜片（規(guī)格1cm×1cm）用剪刀平均剪成兩片，分別用KingFisher核酸提取儀和EZ1核酸提取儀提取純化。

案件樣本：鞋帽手套用脫落細胞粘取器粘取，分別用KingFisher核酸提取儀和硅膠膜吸附法提取純化；刀柄用干濕兩步法擦拭，煙頭直接剪取，分別用KingFisher核酸提取儀和M48法提取純化。

建庫樣本：陳舊疑難血樣分別用KingFisher核酸提取儀和ID-Direct直接擴增。

1.3.2樣本DNA提取純化

KingFisher法：加入240μL消化液ML、20μL濃度為10mg/mL的PK溶液，65℃消化30min，之后12000r/min ，離心3min，將離心后的上清液加入到試劑條中，然后按照試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)程序進行，模板DNA洗脫體積為40μL。

EZ1法：加入190μLG2，20μL濃度為10mg/mL的PK溶液，56℃裂解30min，然后按試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)程序進行，模板DNA洗脫體積為40μL。

M48法：加入190μLG2，20μL濃度為10mg/mL的PK溶液，56℃裂解120min，然后按試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)程序進行，模板DNA洗脫體積為40μL。

硅膠膜吸附法：加入200μL裂解液，20μL濃度為10mg/mL的PK溶液，56℃裂解120min，然后按試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)程序進行，模板DNA洗脫體積為40μL。

1.3.3 DNA擴增

提取得到DNA模板用Identifiler?Plus試劑盒進行復(fù)合擴增，反應(yīng)總體積為10μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃10min；擴增階段94℃ 20s，59℃ 3min，共29個循環(huán)；延伸階段60℃ 10min；保存條件4℃。

1.3.4電泳分析STR分型

PCR產(chǎn)物在ABI-3500XL遺傳分析儀上進行毛細管電泳，應(yīng)用GeneMapper@ID-Xv1.5軟件對電泳數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果

以獲得16個完整清晰的基因座分型為成功檢出，實驗的結(jié)果見表1、圖1～圖4。

表1 DNA檢驗結(jié)果對比表

在KingFisher與EZ1的比較中發(fā)現(xiàn)，KingFisher法獲得9個完整的個體STR分型，EZ1法獲得6個完整的個體STR分型，有3個檢材出現(xiàn)部分位點丟失的情況，而且KingFisher組的檢驗結(jié)果RFU值普遍比EZ1組高。

圖1 KingFisher法提取指紋3

圖2 EZ1法提取指紋3

對于靴帽、手套、工具、陳舊煙頭等檢材，KingFisher法與M48和硅膠膜吸附法獲得相同的結(jié)果，直擴未出的血樣用KingFisher也獲得了完整分型。

圖3 KingFisher法提取刀柄上斑跡

圖4 硅膠膜吸附法提取刀柄上斑跡

3 討論

目前疑難檢材DNA檢驗的方法主要是硅珠法和磁珠法，其原理是利用DNA在一定條件下能與硅（磁）珠結(jié)合，可以進行洗滌純化，再通過改變條件，從硅（磁）珠上收集DNA。影響提取效率的因素主要有硅（磁）珠結(jié)合DNA的量，以及DNA在洗滌過程中損失程度。

市面上的大部分DNA自動化純化儀也主要根據(jù)該原理進行設(shè)計，區(qū)別在于優(yōu)化的步驟不同。充分的硅（磁）珠量和結(jié)合時間可以獲取更多的DNA，洗滌工藝次數(shù)的優(yōu)化，可以有效解決除雜程度和DNA損失的矛盾。

對比KingFisher提取儀和幾種純化方法的純化效果，KingFisher提取儀的純化效果與手工的M48和硅膠膜吸附法相當(dāng)，優(yōu)于EZ1提取純化儀。KingFisher提取儀延長了磁珠的結(jié)合時間，改變以往轉(zhuǎn)移液體的模式，采用轉(zhuǎn)移磁珠的方式，同時確保在磁頭轉(zhuǎn)移時沒有任何掛液現(xiàn)象，最大限度減少洗滌過程的DNA損失，有效富集DNA。時間上，KingFisher儀器單次運行最大通量為24，樣本前期消化時間是30min，儀器后期運行時間是53min，以做24個樣本算，加上手工操作，整體時間約2h，具有較高的純化效率。

綜上所述，KingFisher純化提取儀具有高通量、操作簡單、純化效果好的特點，可以有效解決脫落細胞提取純化問題，適合應(yīng)用于實際案件中各類檢材的檢驗鑒定。

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