● 周怡章 王玉姣 張?zhí)煊?/p>

DNA Taq酶與其在PCR技術(shù)中的應(yīng)用

● 周怡章 王玉姣 張?zhí)煊?/p>

從水生嗜熱菌菌株中分離出的TaqDNA聚合酶，具有熱穩(wěn)定性、忠實(shí)性、離子依賴性以及對(duì)抑制劑敏感等特點(diǎn)，較其他聚合酶更適用于PCR技術(shù)，所以被廣泛應(yīng)用于PCR技術(shù)。另外，部分研究人員也研制出了TaqDNA聚合酶的實(shí)驗(yàn)室制備方法。

DNATaq酶 PCR技術(shù) 熱穩(wěn)定性

1 發(fā)現(xiàn)與命名

最初在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增時(shí)，使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段。但由于Klenow酶不耐熱、易鈍化，DNA模板在進(jìn)行熱變性時(shí)，每次加入的酶只能進(jìn)行一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，這使得PCR技術(shù)的操作程序十分繁瑣。

隨后，有實(shí)驗(yàn)人員把Klenow酶替換為T4DNA聚合酶進(jìn)行基因擴(kuò)增。這種改良使得PCR的程序有所精簡(jiǎn)，擴(kuò)增出的DNA片段均一性、真實(shí)性相對(duì)較高，但仍無(wú)法解決PCR技術(shù)的自動(dòng)循環(huán)的問(wèn)題。

后來(lái)，在美國(guó)黃石國(guó)家森林公園的溫泉中，研究者成功地發(fā)現(xiàn)并提取到生長(zhǎng)溫度為70-75°C的嗜熱桿菌。該菌株內(nèi)含有60-68kDa的DNA聚合酶，其比活性為2000-8000U/mg，這引起了研究人員的注意。在對(duì)其進(jìn)行深度研究后，研究人員又注意到另一種水生嗜熱桿菌Thermus aquaticus（YTI），他們?cè)谶@種嗜熱桿菌中分離出一種93910Da的耐熱性DNA聚合酶，其比活性為200000U/mg，該酶具有熱穩(wěn)定性、忠實(shí)性、離子依賴性以及對(duì)抑制劑敏感的特點(diǎn)，適合應(yīng)用于PCR過(guò)程，故研究人員將此耐熱性DNA聚合酶命名為TaqDNA聚合酶（TaqDNA Polymerase）。TaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)使得PCR逐漸被普及。

2 特點(diǎn)

聚合酶的基因全長(zhǎng)2496bp，共編碼832個(gè)氨基酸，其分子量為94KDa，比活性為200000單位/毫克。

1）熱穩(wěn)定性和酶活性：聚合酶的熱穩(wěn)定性是其用于PCR反應(yīng)的前提，也是使PCR反應(yīng)被廣泛應(yīng)用的重要原因。在75～80℃的條件下，每個(gè)聚合酶每秒可延伸大約150個(gè)核苷酸。然而在70℃時(shí)，每秒其延伸的核苷酸數(shù)量為60個(gè)左右；55℃時(shí)，其延伸速度更低，為24個(gè)核苷酸/秒。所以，溫度過(guò)高(90℃及以上)或過(guò)低(22℃及以下)都可能影響到聚合酶的活性。由于聚合酶具有良好的熱穩(wěn)定性，其在PCR過(guò)程的高溫中仍可保持較高的活性。在92.5℃、95℃、97.5℃時(shí)，PCR混合物中的聚合酶分別經(jīng)130min，40min和5～6min后，仍可保持50%的活性。

2）離子依賴性： 聚合酶是 鎂離子依賴性酶，其催化活性受Mg2+濃度影響。在PCR 反應(yīng)液中，Mg2+會(huì)與dNTP結(jié)合而影響其游離濃度，因而應(yīng)根據(jù)不同要求適當(dāng)調(diào)整 MgCl2濃度。通常情況下，Mg2+濃度需比 dNTP總濃度需至少高 0.5～1.0mmol/L。另外，氯化鉀的濃度也會(huì)影響 聚合酶的催化效能。在PCR 反應(yīng)液中，氯化鉀最適濃度為 50mmol/L。在該濃度下聚合酶的催化效率可提高 50～60%，但氯化鉀濃度高于75mmol/L時(shí)該酶的活性明顯被抑制。[1]

3）忠實(shí)性：聚合酶具有聚合酶活性和 外切酶活性，而無(wú)外切酶活性，也不具有的校對(duì)活性。故在 PCR 反應(yīng)中發(fā)生的部分堿基錯(cuò)配是不會(huì)被該酶校正的。有研究表明， 聚合酶的堿基錯(cuò)配機(jī)率約為 2.1×10-4。

4）抑制劑：甲酰胺、低濃度的尿素、二甲基亞砜(DMSD)和二甲基甲酰胺(DMF)對(duì) 聚合酶的催化作用無(wú)影響。極低濃度的離子表面活性劑如脫氧膽胺酸鈉(小于0.06%)、十二烷基硫酸鈉(SDS，小于0.01%)、十二烷基肌氨酸鈉(小于0.02%)幾乎可完全抑制該酶活性。而非離子表面活性劑，如：Tween20，NP-40和Tritox-100，在相對(duì)高濃度時(shí)可抑制該酶活性。[2]

3 制備和提取

由于Thermus aquaticus水生嗜熱桿菌培養(yǎng)較困難、產(chǎn)量較低，目前大部分實(shí)驗(yàn)室多使用商品化的TaqDNA聚合酶。但目前也有研究人員研制出了實(shí)驗(yàn)室制備方法，并已證實(shí)可有效擴(kuò)增。

含有TaqDNA聚合酶基因的pTaq表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 E.coli菌株可在異丙基硫代-β-D-乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)10 -12h后表達(dá)耐熱性TaqDNA聚合酶。表達(dá)出該酶后使用溶菌酶、NP40裂解細(xì)菌，再進(jìn)一步在4℃下使用硫酸銨沉淀后透析。制備的TaqDNA聚合酶可通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、考馬斯亮藍(lán)法和 PCR等方法確定其純度、濃度和活性。[3]

4 應(yīng)用與前景

耐熱性TaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)對(duì)于PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用有重大意義。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（即PCR）為在體外95°C高溫條件下，DNA變性轉(zhuǎn)化為單鏈，降低溫度（通常約60°C）后引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，進(jìn)一步調(diào)節(jié)溫度至DNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度（即72°C左右）后，DNA聚合酶沿的方向合成互補(bǔ)鏈。如今，在臨床工作中PCR技術(shù)也得到了應(yīng)用。PCR在檢驗(yàn)學(xué)中最有意義的部分是對(duì)感染性疾病的診斷。另外PCR技術(shù)可檢測(cè)基因突變和癌基因的表達(dá)量，對(duì)腫瘤早期診斷、分型、分期和預(yù)后判斷有重要意義。

（作者單位：山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院）

[1]丁燕華,劉樹濤,齊慶遠(yuǎn)等.Taq DNA聚合酶的熱純化制備[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)(英文版),2011,12(3):375-378

[2]王天云,秦川,楊瑞等.基因重組TaqDNA酶的制備.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,24(6):551-553

[3]肖朝文,杜鵑,李晚忱.Taq DNA聚合酶制備技術(shù)的優(yōu)化[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,22(4):318-321