陳清嬋，朱娜娜，孫愛(ài)紅

（荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北荊門448000）

橘子酒生香酵母的優(yōu)選研究

陳清嬋，朱娜娜，孫愛(ài)紅

（荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北荊門448000）

通過(guò)對(duì)從橘子果實(shí)上分離篩選出的3株天然野生菌株和5株商業(yè)果酒酵母的發(fā)酵速度、發(fā)酵力、感官品質(zhì)和氣相分析結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)比較研究，從中篩選出適宜橘子酒釀造的優(yōu)良生香酵母菌株JZ-3。發(fā)酵力為0.20 g/g·d，主發(fā)酵速度相對(duì)較低，到發(fā)酵后期的速度平緩，對(duì)于果酒香氣的形成和風(fēng)味物質(zhì)的積累十分有利,釀造出來(lái)的橘子酒品質(zhì)最佳，酒體呈現(xiàn)出淺橘黃色，較為澄清透明，且酒體光澤度好，具有橘子清新的果香和純正、協(xié)調(diào)的酒香，具有典型性，酒的整體品質(zhì)較高。

橘子酒；香氣；生香酵母

橘子酒是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的低酒精度果酒，風(fēng)味品質(zhì)是其重要的質(zhì)量指標(biāo)。正常果酒應(yīng)該酒香醇厚，果香濃郁，具有典型性。但市場(chǎng)上的橘子酒卻呈現(xiàn)果香味淡薄、品質(zhì)不高、典型性不足的現(xiàn)狀。酵母是影響果酒品質(zhì)的重要因素，在橘子酒釀造中，缺乏專用生香酵母一直是影響橘子酒品質(zhì)的重要原因。國(guó)內(nèi)對(duì)獼猴桃果酒[1]及其他果酒生香酵母及其性能都做過(guò)研究[2-6]，但在柑橘果酒方面，國(guó)內(nèi)研究多集中在釀造工藝[7-8]及選育適宜釀酒的酵母方面[9-13]，在橘子酒生香酵母方面研究比較少。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)從橘子果實(shí)上分離篩選出的天然野生優(yōu)良菌株和優(yōu)選的商業(yè)果酒酵母的釀造性能、所釀造橘子酒的感官品質(zhì)和生香性能進(jìn)行系統(tǒng)比較研究，從中篩選出生香能力強(qiáng)并且橘子香氣物質(zhì)保留最好的優(yōu)良酵母菌株，為進(jìn)一步研究橘子酒專用生香酵母提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：橘子，荊門本地產(chǎn)；白砂糖，武漢廣盛元食品有限公司；陳釀紅葡萄酒專用酵母、白葡萄酒專用酵母、X16酵母、23 23酵母、安琪果酒酵母，煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司。

主要試劑：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（分析純），Beijing Solarbio Science；亞硫酸（分析純），天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；無(wú)水硫酸鈉（分析純），天津市福晨化學(xué)試劑廠；二氯甲烷（分析純），天津市福晨化學(xué)試劑廠；丙酮（分析純），國(guó)藥試劑；無(wú)水乙醇（分析純），武漢市洪山中南北化工試劑有限公司。

儀器設(shè)備：JJ-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州金凈科技儀器有限公司；LRH-150-S恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；YQL-100S11高壓滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備；GL21M離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；ZHWY-200B恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器制造有限公司；GC-4000A氣相色譜儀，北京東西電子。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 橘子酒野生酵母的分離純化

本實(shí)驗(yàn)從橘子果實(shí)上分離純化野生釀酒酵母。挑選腐爛并帶有酒香味的橘子于無(wú)菌水中制得懸菌液，在28℃PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)3 d，觀察其菌落特征，分離出單個(gè)菌落，逐步進(jìn)行分離純化。將適宜菌株轉(zhuǎn)移至試管斜面以28℃進(jìn)行增殖培養(yǎng)，3 d后轉(zhuǎn)移到4℃冰箱中保藏備用，使用前用橘子清汁擴(kuò)大培養(yǎng)24 h。

1.2.2 橘子酒釀造工藝

調(diào)糖：用白砂糖調(diào)整橘子汁糖度為20°Bx。

調(diào)SO2：用亞硫酸調(diào)整SO2濃度為100 mg/L。

橘子清汁：橘子剝皮、榨汁、過(guò)濾、調(diào)整可溶性固形物為20°Bx，加入亞硫酸調(diào)整SO2濃度為100 mg/L，獲得可直接使用的橘子清汁，冰箱低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌種活化

斜面酵母菌株的活化：用接種環(huán)取1環(huán)保存的斜面酵母轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)24～48 h，至酵母長(zhǎng)滿斜面。

干酵母的活化：稱取0.02 g干酵母，置于調(diào)好的100 mL橘子清汁中于30℃水浴鍋中水浴活化15 min。

1.2.4 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)

從活化斜面培養(yǎng)基上取1環(huán)活化菌種接入50 mL經(jīng)滅菌處理的橘子清汁中，28℃搖床培養(yǎng)24 h振蕩速度120 r/min。

1.2.5 各酵母菌株的發(fā)酵速度與發(fā)酵力比較

分別將各菌株擴(kuò)大培養(yǎng)液按5%的體積比例接入到100 mL橘子清汁中，搖勻后25℃培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵，每隔24 h稱重1次記錄CO2失重量，至相鄰2次失重之差小于0.1 g為發(fā)酵終點(diǎn)，終止發(fā)酵，將發(fā)酵液于4000 r/min離心10 min，收集各菌株發(fā)酵后的菌泥，并稱重，按公式計(jì)算各菌株的酵母發(fā)酵力，同時(shí)繪制橘子汁發(fā)酵液失重與發(fā)酵時(shí)間曲線，比較各酵母菌株發(fā)酵速度的快慢。

單位酵母發(fā)酵力（g/g·d）=CO2失重量/菌泥重×發(fā)酵時(shí)間。

1.2.6 各菌株釀造橘子酒感官評(píng)定

參照葡萄酒評(píng)比標(biāo)準(zhǔn)（OIV公布）結(jié)合葡萄酒果酒通用分析方法（GB/T 15038—2006）由5名人員(男女比例3∶2)對(duì)各菌株釀造橘子酒進(jìn)行感官評(píng)定，評(píng)定指標(biāo)及分值見表1。

1.2.7 各菌株釀造橘子酒香氣比較

1.2.7.1 二氯甲烷萃取香氣物質(zhì)

取離心后的樣品50mL，分別用20mL、20mL和10mL的二氯甲烷連續(xù)萃取3次。萃取的香氣物質(zhì)，用3 g無(wú)水硫酸鈉干燥24 h，第2天將干燥好的樣品進(jìn)行過(guò)濾，注意要保證樣品中不能有水分，將樣品裝入1 mL的棕色瓶中，作為樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7.2 氣相分析檢測(cè)

GC條件：DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；程序升溫為初溫40℃，保留5 min，然后以2℃/min升溫至60℃，再以3℃/min升溫至230℃保留5 min，設(shè)置氣化室A溫度為250℃，氫焰為150℃，溫度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)后，點(diǎn)火，30 min后待基線平穩(wěn)，用進(jìn)樣器取1μL樣品迅速打入機(jī)器中，待樣品充分揮發(fā)后，統(tǒng)計(jì)出峰結(jié)果。

1.2.7.3 氣相分析數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)

分析統(tǒng)計(jì)橘子清汁及各酵母所釀橘子酒香氣物質(zhì)數(shù)量，以歸一化計(jì)算各香氣物質(zhì)的峰面積，作為各香氣成分的相對(duì)含量。根據(jù)香氣物質(zhì)種類數(shù)及含量比較各菌株的生香性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 橘子酒酵母的分離、純化

經(jīng)富集培養(yǎng)以及反復(fù)分離、純化操作，得符合酵母特征的酵母菌3株，命名為JZ-1、JZ-2、JZ-3。通過(guò)觀察,其菌落、菌體特征分別見圖1—圖3。

從圖1可知，JZ-1酵母菌落呈乳白色，圓形，邊緣無(wú)絨毛，大而厚，有一定凸起度，表面有光澤且黏稠，易挑起，菌落質(zhì)地均勻，正反面和邊緣、中央部位顏色都很均一。

從圖2可知，JZ-2酵母菌落呈微黃色近透明小菌落，圓形，邊緣光滑，略微凸起，表面有光澤黏稠，易挑起，均一性良好。

從圖3可知，JZ-3酵母菌落呈微黃色小菌落，數(shù)量多，橢圓形，邊緣有小絨毛，略微凸起，表面有光澤黏稠，易挑起。

2.2 各菌株發(fā)酵力比較

通過(guò)對(duì)野生分離的3株酵母菌株和商用5株果酒酵母在橘子清汁中發(fā)酵過(guò)程中5 d內(nèi)CO2的總失重量及各菌株的總菌泥重，通過(guò)公式計(jì)算比較8株酵母菌的單位酵母發(fā)酵力，結(jié)果見表2。

由表2可知，安琪酵母、JZ-1、紅葡萄酒專用酵母、白葡萄酒專用酵母等發(fā)酵力明顯高于其他4株酵母，均達(dá)到了0.37 g/g·d以上，安琪酵母甚至達(dá)到了0.43 g/g·d，而JZ-2、JZ-3、23 23等酵母的發(fā)酵力都比較低，分別為0.19 g/g·d、0.20 g/g·d、0.16 g/g·d。發(fā)酵力越低，發(fā)酵速度相對(duì)越平穩(wěn)，對(duì)果酒香氣的形成和風(fēng)味物質(zhì)的積累越有利，而發(fā)酵力高的酵母，其發(fā)酵速度快，酒的風(fēng)味相對(duì)較烈不夠協(xié)調(diào)柔和。單位酵母發(fā)酵力相對(duì)越低，更有利于提高橘子酒整體質(zhì)量。因此JZ-2、JZ-3、23 23酵母更適于作為優(yōu)選生香酵母菌株。

2.3 各菌株發(fā)酵速度比較

通過(guò)對(duì)野生分離的3株酵母菌株和商用5株果酒酵母在橘子清汁發(fā)酵過(guò)程中5 d內(nèi)CO2的失重量統(tǒng)計(jì)，繪制CO2失重量隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線，即8株酵母菌株的發(fā)酵速度曲線，結(jié)果見表3。

由表3可知，8種菌株發(fā)酵速度呈3種不同趨勢(shì)。紅葡萄酒釀酒酵母、X16、23 23這3株酵母起酵速度最快，主發(fā)酵速度較快，發(fā)酵延滯期短；JZ-1、安琪酵母、白葡萄酒專用釀酒酵母等3株酵母發(fā)酵速度先降后升，并且主發(fā)酵速度最快，但延滯期最短，到達(dá)最高發(fā)酵速度后立刻下降；JZ-2、JZ-3菌株啟發(fā)速度較慢且平緩，延滯期最長(zhǎng)。發(fā)酵速度快，酒的風(fēng)味相對(duì)較烈不夠協(xié)調(diào)柔和。主發(fā)酵速度相對(duì)較慢，到發(fā)酵后期的速度更為平緩，對(duì)于果酒香氣的形成和風(fēng)味物質(zhì)的積累十分有利，可提高橘子酒品質(zhì)。因此，JZ-2、JZ-3菌株更適于作為優(yōu)選菌株。

2.4 各菌株釀造橘子酒感官品質(zhì)比較

由表4可知，菌株JZ-3所釀橘子酒的外觀、滋味、香氣和典型性都比較好，綜合得分排在第一位。JZ-1、安琪、23 23所釀橘子酒外觀、香氣都不理想。陳釀紅葡萄酒專用酵母所釀橘子酒典型性差，橘子原來(lái)香氣保留太少，白葡萄酒專用酵母所釀橘子酒酒香果香單薄,典型性差，X16、23 23所釀橘子酒香氣略勝于白葡萄酒和紅葡萄酒專用酵母，但外觀較前者差，典型性同樣比較差。安琪整體品質(zhì)居中，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)遜色于菌種JZ-3所釀橘子酒。陳釀紅葡萄酒專用酵母、白葡萄酒專用酵母、X16、23 23等所釀橘子酒略帶苦澀辛酸氣味，整體雜味比較多，口感差。通過(guò)比較可知，菌株JZ-3的釀造性能顯著優(yōu)于其他酵母菌株，釀造的橘子酒外觀好，酒體呈現(xiàn)出淺橘黃色，較為澄清透明，且酒體光澤度好；酒體較豐滿、醇厚爽口；香氣特征為具有橘子清新的果香和純正、協(xié)調(diào)的酒香，能很好體現(xiàn)橘子酒的典型性，酒的整體品質(zhì)較高。

2.5 各菌株釀造橘子酒香氣比較（表5、表6）

由表5可知，通過(guò)氣相色譜法分析檢測(cè)，橘子清汁含氣味物質(zhì)22種，但相對(duì)含量都比較低；陳釀紅葡萄酒專用酵母、白葡萄酒專用酵母所釀橘子酒氣味物質(zhì)種類最多，分別為30種、40種；JZ-1、23 23等酵母所釀橘子酒氣味物質(zhì)種類最少，分別為12種、19種，甚至低于橘子清汁氣味物質(zhì)種類；并非所有氣味物質(zhì)都有利于橘子酒香氣形成，由于儀器設(shè)備限制不能檢測(cè)出氣味物質(zhì)具體成分，故通過(guò)對(duì)氣相分析所得數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)得到各菌株所釀橘子酒橘子清汁香氣物質(zhì)保留數(shù)量。

由表6可知，JZ-3酵母菌株保留橘子清汁香氣物質(zhì)10種，總含量5.7642%，是8株酵母中保留種類最多、含量最大的一種；安琪酵母適用于大部分果酒釀造，所以在橘子清汁香氣物質(zhì)保留數(shù)量和含量方面都僅次于JZ-3酵母菌株，居第二位；JZ-1、X16、23 23等酵母菌株橘子清汁香氣物質(zhì)保留最少。因此，JZ-3酵母菌株發(fā)酵橘子酒，橘子果味典型性最好，這與感官評(píng)定的結(jié)果相符。

3 結(jié)論

在8株釀酒酵母中，JZ-3菌株菌落呈白色，圓形，較厚，有一定的凸起，邊緣略微鋸齒狀，表面有光澤且有彈性，易挑起。發(fā)酵力為0.20 g/g·d，主發(fā)酵速度相對(duì)較低，到發(fā)酵后期的速度平緩，對(duì)于果酒香氣的形成和風(fēng)味物質(zhì)的積累十分有利,氣相分析得JZ-3菌株所釀橘子酒含香氣物質(zhì)22種，保留橘子清汁香氣物質(zhì)10種，含量為5.7642%。感官評(píng)價(jià)得分87.8分，釀造出來(lái)的橘子酒品質(zhì)最佳，酒體呈現(xiàn)出淺橘黃色，較為澄清透明，且酒體光澤度好，酒體較豐滿、醇厚爽口，香氣特征具有橘子清新的果香和純正、協(xié)調(diào)的酒香，具有典型性，酒的整體品質(zhì)較高。

[1]羅安偉.獼猴桃酒生香酵母的選育[D].西安:西北農(nóng)林科技大學(xué),2012(4)：36-67.

[2]王國(guó)良.生香酵母及其應(yīng)用[J].食品研究開發(fā),2007(3)：16-29.

[3]傅金泉.生香酵母在黃酒生產(chǎn)上應(yīng)用的研究初報(bào)[J].釀酒科技,1996(5)：50.

[4]汪立平.蘋果酒釀造中香氣物質(zhì)的研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué), 2004.

[5]許玲.幾株生香酵母的分離篩選及應(yīng)用[J].釀酒科技,2010 (12)：48-54.

[6]周世水.酒曲中生香酵母的分離鑒定與產(chǎn)酯工藝優(yōu)化[J].現(xiàn)代食品科技,2010(1)：90-108.

[7]潘訓(xùn)海,左勇.錦橙果酒開發(fā)研究[J].四川食品與發(fā)酵,2007 (4)：40-44.

[8]陳清嬋,簡(jiǎn)清梅,王勁松,等.蜜桔果酒發(fā)酵工藝[J].中國(guó)釀造, 2015,34(1)：169-171.

[9]陳茂彬,何平,曾瑩.柑橘酒釀造酵母的篩選及特性研究[J].釀'酒科技,2007(1)：20-22.

[10]游見明.橘子酒酵母的分離篩選[J].中國(guó)釀造,2009(4)：55-57.

[11]熊子書.中國(guó)釀酒酵母菌的研究[J].釀酒科技,2002(4)：23-27.

[12]李靜.果酒釀造中優(yōu)良酵母菌株的篩選[J].釀酒科技,2008 (2)：63-65.

[13]權(quán)英,張偉,李長(zhǎng)文,等.釀造紅棗果酒的酵母菌選種研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30(11)：39-41.

Screening of Aroma-Producing Yeast Strains for Orange Wine

CHEN Qingchan,ZHU Nana and SUNAihong
(College of Bioengineering,Jingchu University of Technology,Jingmen,Hubei 448000,China)

The fermenting rate,fermenting power,sensory quality,and GC analytic results of 3 wild yeast strains isolated from orange fruit and 5 commercially-available fruit wine yeast strains were compared.Finally,yeast strain JZ-3,suitable for orange wine production,was screened out.Its fermenting power was 0.20 g/g.d,and its fermenting rate was comparatively low in chief fermentation period and was stable in late fermenting period,which was beneficial to the formation of wine aroma and the accumulation of flavoring substances in wine.The wine produced by strain JZ-3 was pale orange yellow in color,clear and transparent with good gloss.Besides,the wine had pure orange aroma and harmonious taste and its overall quality was high.

orange wine;aroma;aroma-producing yeast

TS262.7；TS261.1；TS261.4

A

1001-9286（2017）03-0065-04

10.13746/j.njkj.2016367

湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目（Q20154304）。

2016-12-09

陳清嬋（1983-），女，講師，博士，研究方向?yàn)轱L(fēng)味食品，E-mail：xiaochan434@hotmail.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2017-02-13；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170213.0943.001.html。