□ 劉錦鶴 沈陽(yáng)食品檢驗(yàn)所

植物油DNA的高效提取方法

□ 劉錦鶴 沈陽(yáng)食品檢驗(yàn)所

本文優(yōu)化高效提取植物油中DNA的方法，以市場(chǎng)上日?？刹少?gòu)的食用植物油為實(shí)驗(yàn)原料，并利用多種檢測(cè)方法評(píng)價(jià)優(yōu)化的硅膜吸附柱法提取效率。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的提取方法具有可靠的提取質(zhì)量，提取效率高，便于后續(xù)植物油基因檢測(cè)工作的良好開(kāi)展。

植物油；DNA；提取方法

近年來(lái)，食品安全問(wèn)題越來(lái)越得到社會(huì)各界的關(guān)注與重視，尤其是人們每天接觸的食用植物油。近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因原料濫用、原料摻假、地溝油違法使用等方面的問(wèn)題頻發(fā)，在鑒定檢測(cè)中，就逐漸突顯出分子生物學(xué)檢測(cè)的重要作用。檢測(cè)食用植物油的DNA時(shí)，首要工作是將其中的DNA提取出來(lái)。然而，由于食用植物油生產(chǎn)加工過(guò)程中采用的工藝使其中的核酸發(fā)了生嚴(yán)重降解，DNA含量極低，再加上混雜多種其他成分，更增加了DNA提取的難度。盡管國(guó)內(nèi)外提出了眾多提取食用植物油DNA的方法，但大多操作繁瑣、提取效率低、無(wú)法實(shí)現(xiàn)通用。所以，積極構(gòu)建能夠避免這些問(wèn)題的高效提取方法，在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中是急需解決的問(wèn)題。

1 植物油DNA高效提取方法概述

近年來(lái)，摻假植物油、轉(zhuǎn)基因作物制成的植物油較多出現(xiàn)在消費(fèi)市場(chǎng)中。植物油摻假不僅會(huì)影響消費(fèi)者的身體健康，而且也會(huì)嚴(yán)重?fù)p害及侵犯消費(fèi)者的利益及權(quán)利。2015年，頒布實(shí)施的《食品安全法》更加要求所有以轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品為原料生產(chǎn)加工的食品必須在包裝上有明確的標(biāo)識(shí)[1]?；诖朔N現(xiàn)狀，本文以非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆、市售食用植物油為研究材料，分析硅膜吸附柱法對(duì)提高植物油DNA的提取效果的可行性。

本文使用的非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆均來(lái)源于農(nóng)科院；食用植物油購(gòu)買于超市中，共涉及5個(gè)品牌11種產(chǎn)品，其中分別為深海魚(yú)油調(diào)和油（轉(zhuǎn)基因）、谷維多稻米油、食用調(diào)和油（轉(zhuǎn)基因）、菜籽油（轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因2種）、天然谷物調(diào)和油（轉(zhuǎn)基因）、一級(jí)大豆油（轉(zhuǎn)基因）、壓榨玉米油（非轉(zhuǎn)基因）、一級(jí)大豆油（轉(zhuǎn)基因）、食用調(diào)和油（轉(zhuǎn)基因）和有機(jī)壓榨大豆油（非轉(zhuǎn)基因）。

1.1 提取方法

利用硅膜吸附柱法提取植物油DNA過(guò)程中，使用的試劑主要包含CTAB緩沖液、MgSO4、TE緩沖液、70%乙醇和Taqman DNA聚合酶等；利用離心柱、水浴鍋、電泳設(shè)備等實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)展。

將1 mL食用植物油、400 μL TE緩沖液共同加入1.5 mL離心管中，經(jīng)5 min顛倒混勻后，室溫下12 000 r/min離心1 min。上層油脂層去除后，再次將1 mL食用植物油加入離心管中，離心，上層油脂層去除，此過(guò)程共重復(fù)20次，富集待測(cè)樣品中的DNA。DNA提取采用水相，CTAB緩沖液400 μL加入其中，進(jìn)行1～3 s振蕩提取，30 min溫育，溫度65 ℃，之后將500 μL異丙醇、2 μg鮭魚(yú)精子DNA均加入，混勻后放置2 h，溫度-20℃。于硅膜吸附柱中加入上述所有溶液，離心1 min，速度8 000 r/min，收集管中廢液去除，500 μL 70%乙醇（事先經(jīng)4 ℃預(yù)冷）加入吸附柱中，再離心1 min，速度12 000 r/min，收集管中廢液去除，重復(fù)洗滌1次。液體揮干在室溫下進(jìn)行，或放置在核酸真空干燥系統(tǒng)中進(jìn)行。吸附柱去除，于干凈離心管中放置，30 μL TE緩沖液（事先預(yù)熱，溫度65～70 ℃）加入吸附膜中間，溶解DNA，保存條件為4 ℃。

1.2 檢測(cè)DNA提取結(jié)果

采取普通PCR法、恒溫LAMP法、實(shí)時(shí)熒光PCR法分別檢測(cè)提取的DNA，各檢測(cè)方法在檢測(cè)過(guò)程中嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行，并觀察對(duì)比檢測(cè)結(jié)果。

2 硅膜吸附柱法提取植物油DNA結(jié)果評(píng)價(jià)

利用普通PCR法、恒溫LAMP法、實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)其提取結(jié)果時(shí)，分為兩個(gè)方面：①內(nèi)源基因的PCR擴(kuò)增，食用植物油DNA經(jīng)吸附柱法富集提取之后，二次進(jìn)行內(nèi)源基因PCR擴(kuò)增，內(nèi)源基因包含大豆內(nèi)源Lectin、玉米內(nèi)源Adhl、水稻內(nèi)源SPS、油菜內(nèi)源HMG I/Y，檢測(cè)DNA的提取效果。擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分離條帶結(jié)果顯示，待測(cè)樣品均具有清晰的目的基因條帶，其中出現(xiàn)兩種內(nèi)源基因條帶的有4種植物油，分別為天然谷物調(diào)和油、兩個(gè)品牌的食用調(diào)和油、深海魚(yú)油調(diào)和油，擴(kuò)增條帶分別為內(nèi)源基因Lectin、HMG I/ Y；②外源基因CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、EPSPS等外源基因的檢測(cè)，食用植物油DNA經(jīng)吸附柱富集提取之后，二次進(jìn)行外源基因PCR擴(kuò)增，以擴(kuò)增條帶為依據(jù)，對(duì)植物油檢測(cè)結(jié)果做出定性判斷，觀察其中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果顯示，目的基因條帶在轉(zhuǎn)基因大豆、天然谷物調(diào)和油、兩個(gè)品牌的一級(jí)大豆油、兩個(gè)品牌的食用調(diào)和油、深海魚(yú)油調(diào)和油和轉(zhuǎn)基因菜籽油樣品中均出現(xiàn)，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因成分包含在這7種產(chǎn)品中。

本研究采取硅膜吸附柱富集處理提取食物植物油的DNA，通過(guò)利用核酸在水相中的溶解度遠(yuǎn)大于有機(jī)相的原理，有效提高裂解液中萃取到的核酸。并利用普通PCR法、恒溫LAMP法與實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)提取的植物油產(chǎn)品DNA，無(wú)論是各種作物的內(nèi)源基因，或是轉(zhuǎn)基因作物的外源基因，均能獲得清晰的目的基因條帶[2]。但是增加富集處理步驟，大大延長(zhǎng)了提取時(shí)間。因此，在后續(xù)的工作中還需要進(jìn)一步研究調(diào)整，以期在不影響提取結(jié)果的前提下，盡量減少富集處理次數(shù)。

3 結(jié)語(yǔ)

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，硅膜吸附柱對(duì)提取植物油DNA的提取效率及可靠性均比較好，樣品轉(zhuǎn)基因檢測(cè)結(jié)果與食用油的轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)一致，可以在轉(zhuǎn)基因成分分析中廣泛應(yīng)用。

[1]王鳴秋，劉艷，楊碩，等．幾種食用植物油DNA提取方法效果比較[J]．食品安全導(dǎo)刊，2017(9)：154-156．

[2]齊玲 ，劉秀，丁夢(mèng) ，等．植物油DNA提取和基因檢測(cè)研究進(jìn)展[J]．食品研究與開(kāi)發(fā)，2016(1)：220-224．