●嚴(yán)如慶

肺結(jié)核輔助檢查回顧及比較

●嚴(yán)如慶

肺結(jié)核對(duì)大多數(shù)人來說并不陌生，歷史上許多名人都因此病而終，如古代的周瑜、林黛玉，近代的魯迅、郁達(dá)夫，國(guó)外的肖邦、契訶夫等，肺結(jié)核臨床診斷除癥狀體征及典型的影像學(xué)表現(xiàn)外，還依賴于其他輔助實(shí)驗(yàn)室檢查，尤其判斷是否為活動(dòng)性肺結(jié)核及是否需要治療的必需條件，如痰抗酸染色、PPD試驗(yàn)、結(jié)核抗體、結(jié)合蛋白芯片、r-干擾素釋放試驗(yàn)、痰Gene Xpert檢測(cè)、結(jié)核桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)等，其實(shí)驗(yàn)室確診金標(biāo)準(zhǔn)仍依賴于結(jié)核桿菌培養(yǎng)，但一般臨床中該類證據(jù)不典型，很難收據(jù)齊全，故造成肺結(jié)核臨床診斷困難，判斷其活動(dòng)性更加不易，以下就該類輔助實(shí)驗(yàn)室檢查分開論述。

肺結(jié)核；臨床診斷；通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

1 痰抗酸染色

分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經(jīng)過加熱和延長(zhǎng)染色時(shí)間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。齊-尼氏抗酸染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合成復(fù)合物，用鹽酸酒精處理也不脫色。當(dāng)再加堿性美蘭復(fù)染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細(xì)菌及背景中的物質(zhì)為藍(lán)色。

2 PPD試驗(yàn)

基于Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)原理的一種皮膚試驗(yàn)，用來檢測(cè)機(jī)體有無感染過結(jié)核桿菌。凡感染過結(jié)核桿菌的機(jī)體，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的致敏淋巴細(xì)胞，具有對(duì)結(jié)核桿菌的識(shí)別能力。當(dāng)再次遇到少量的結(jié)核桿菌或結(jié)核菌素時(shí)，致敏T淋巴細(xì)胞受相同抗原再次刺激會(huì)釋放出多種可溶性淋巴因子，導(dǎo)致血管通透性增加，巨噬細(xì)胞在局部集聚，導(dǎo)致浸潤(rùn)[1]。約在48～72小時(shí)內(nèi)，局部出現(xiàn)紅腫硬節(jié)的陽性反應(yīng)。若受試者未感染過結(jié)核桿菌，則注射局部無變態(tài)反應(yīng)發(fā)生。

3 結(jié)核抗體

感染結(jié)核分支桿菌后，體內(nèi)可產(chǎn)生特異性抗體，目前臨床可查結(jié)核抗體IgG及IgM。將結(jié)核分支桿菌抗原包被在固相載體上，與待測(cè)血清反應(yīng)，血清中相應(yīng)的抗體可結(jié)合于其上，再以膠體金（或酶）標(biāo)記，顯示反應(yīng)，可檢出血清中結(jié)核分支桿菌抗體。結(jié)核抗體陽性率為80%～90%左右，表示有結(jié)核分支桿菌感染，其靈敏度超過90%和特異性超過85%。

4 結(jié)核蛋白芯片

與抗酸染色法、痰結(jié)核菌常規(guī)培養(yǎng)法比較，生物蛋白芯片技術(shù)具有檢測(cè)速度快，敏感性和特異性高的特點(diǎn)。對(duì)診斷結(jié)核桿菌感染、動(dòng)態(tài)觀察結(jié)核病患者的療效有良好作用。生物蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌抗體。較敏感、特異性強(qiáng)又純化的抗原為細(xì)胞壁的脂阿拉伯甘露糖(LAM)、16kDa蛋白和38kDa蛋白。LAM是構(gòu)成結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的重要組成成分，其特異性強(qiáng)，能刺激結(jié)核感染者產(chǎn)生抗體；16kDa蛋白是有潛力的免疫診斷抗原；38kDa蛋白為脂蛋白，其與細(xì)胞膜或菌體表面的脂肪結(jié)構(gòu)相連。對(duì)小兒來說，只要感染過結(jié)核菌，結(jié)核抗體試驗(yàn)就呈陽性反應(yīng)，它只是診斷結(jié)核感染的一個(gè)參考，不能說一定就是結(jié)核病。國(guó)人大多年長(zhǎng)兒及成人感染過結(jié)核菌，絕大多數(shù)人是不發(fā)病的。這和兒科結(jié)核菌素試驗(yàn)(PPD)檢查一樣，也是診斷結(jié)核病的一個(gè)參考，結(jié)核菌素試驗(yàn)是在皮內(nèi)注射0.1ml的藥液，48-72小時(shí)看結(jié)果，PPD試驗(yàn)也只有強(qiáng)陽性(需配合臨床表現(xiàn)和胸片等其他檢查)才有意義。如呈陰性反應(yīng)，就說明沒感染結(jié)核菌；弱陽性和陽性反映，也只能說明感染了結(jié)核菌，不能確診為結(jié)核病。臨床發(fā)現(xiàn)，LAM、38kDa抗體檢出率可能與年齡增加、機(jī)體抵抗力或免疫力下降有關(guān)。其結(jié)果隨結(jié)核病患者的年齡增加而升高，因此采用生物蛋白芯片技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)3種結(jié)核抗體，可提高其診斷結(jié)核的敏感性和特異性，也可作為結(jié)核病的血清學(xué)診斷方法之一。研究證實(shí)，門診及住院結(jié)核病患者痰抗酸染色陽性患者的LAM、16kDa、38kDa抗體檢出率均較高，而經(jīng)過治療的患者的3種結(jié)核抗體檢出率均較低。結(jié)核病的免疫特征是細(xì)胞免疫功能低下，體液免疫功能增強(qiáng)，當(dāng)治療有效、感染控制后，LAM、16kDa、38kDa抗體水平下降。說明生物蛋白芯片技術(shù)能動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)這3種結(jié)核抗體，用于結(jié)核病的藥物治療選擇。生物蛋白芯片技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌抗體的檢測(cè)，可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)血清中相應(yīng)的多種抗體，可以診斷小兒結(jié)核感染。同時(shí)，在不同人群中篩查出不同的抗體類型，可能為臨床結(jié)核病的診斷及預(yù)后估測(cè)等提供重要的依據(jù)。

5 r-干擾素釋放試驗(yàn)

γ干擾素釋放試驗(yàn)分析技術(shù)IGRA是一種用于結(jié)核桿菌感染的體外免疫檢測(cè)的新方法。原理是：人體感染結(jié)核桿菌，會(huì)產(chǎn)生特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，當(dāng)使用結(jié)核桿菌特異抗原刺激后，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時(shí)會(huì)分泌INF-r，結(jié)核桿菌特異抗原主要是ESAT-6以及CFP-10。與PPD比較，其最大優(yōu)勢(shì)是，由于刺激的抗原為結(jié)核桿菌所特有，其結(jié)果陽性基本可以排除卡介苗接種或非結(jié)核分枝桿菌感染。IGRA利用結(jié)核分枝桿菌而非牛分枝桿菌BCG株系表達(dá)的抗原刺激外周血單核產(chǎn)生IFN-γ，檢測(cè)結(jié)果在血樣采集后12至18小時(shí)得出，報(bào)告結(jié)果分為陽性、陰性和不確定。大型臨床研究顯示，在高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)室中不確定結(jié)果的發(fā)生率僅為2%～4%，因此獲得有意義結(jié)果的幾率均超過96%。

IGRAs陽性意味著曾經(jīng)感染結(jié)核桿菌，至于何時(shí)感染、感染后是否會(huì)發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核病，IGRAs都不能給我們以幫助。對(duì)IGRAs的過度使用有可能將我們帶入結(jié)核病診斷誤區(qū)。在大量數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)上，WHO對(duì)使用IGRAs提出以下建議：（1）在結(jié)核病中、低收入國(guó)家尤其是結(jié)核病/HIV高負(fù)擔(dān)地區(qū)，開展IGRAs常規(guī)檢測(cè)還缺乏有力證據(jù)；（2）IGRAs和TST都不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)個(gè)體感染結(jié)核桿菌后發(fā)展為活動(dòng)結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)；（3）IGRAs和TST都不應(yīng)用于活動(dòng)結(jié)核的診斷；（4）和TST相比，IGRAs更昂貴，技術(shù)更復(fù)雜。

6 結(jié)核桿菌培養(yǎng)

結(jié)核桿菌培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用相當(dāng)廣泛，在痰抗酸染色陽性率不高的情況下，查痰結(jié)核桿菌培養(yǎng)尤其重要，并且結(jié)果可以針對(duì)性的做耐藥檢測(cè)，但時(shí)限相對(duì)長(zhǎng)，因?yàn)樘到Y(jié)核桿菌生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，一般需要2-3月時(shí)間才能看到菌落，故得到耐藥檢測(cè)結(jié)果也至少在3月以后，同時(shí)痰結(jié)核桿菌培養(yǎng)可以彌補(bǔ)痰抗酸染色陽性率不高的缺點(diǎn)，對(duì)部分實(shí)際結(jié)核活動(dòng)而涂陰的患者最終可以做出陽性培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行臨床指導(dǎo)治療，也可以追蹤部分涂陰但培陽患者更改治療方案。

7 分析比較

痰抗酸染色方法在一般實(shí)驗(yàn)室均可開展，但其陽性結(jié)果的檢出率與痰標(biāo)本本身的質(zhì)量、留取的標(biāo)準(zhǔn)與否、實(shí)驗(yàn)室操作的規(guī)范及操作人員的經(jīng)驗(yàn)有很大關(guān)系，通常在規(guī)范實(shí)驗(yàn)室陽性檢出率低于30%，特異性高，一旦發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果，基本考慮結(jié)核活動(dòng)，但需同時(shí)查結(jié)核桿菌培養(yǎng)等待1-2月排除非結(jié)核感染如MAC感染的可能性，對(duì)于區(qū)域結(jié)核感染嚴(yán)重或有活動(dòng)性結(jié)核接觸的患者，臨床指導(dǎo)意義較大，缺點(diǎn)就是陽性率低，實(shí)驗(yàn)室條件達(dá)標(biāo)、標(biāo)本合格、操作規(guī)范的陽性率20-30%左右，對(duì)真正結(jié)核感染者假陰性率相對(duì)高，作為結(jié)核篩查的常規(guī)檢查，運(yùn)用廣泛。

PPD試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，目前純結(jié)核蛋白衍生物1支50元左右，可同時(shí)為1-6人進(jìn)行試驗(yàn)，在左肢前臂外1/3掌側(cè)皮內(nèi)注射觀察48-72h，一般以72結(jié)果為主，若陰性（5mm以內(nèi)）考慮無結(jié)核感染，但需1-3周內(nèi)復(fù)查，排除結(jié)核感染窗口期或因免疫抑制造成的無應(yīng)答可能，若陽性（硬結(jié)小于15mm）考慮患者體內(nèi)存在結(jié)核桿菌并產(chǎn)生了免疫性抗體，但不能說明有活動(dòng)性結(jié)核病，需通過其他臨床癥狀、體征、DR、CT等輔助檢查判斷，若硬結(jié)大于15mm或出現(xiàn)大面積水泡、紅腫、疼痛等比較重的變態(tài)反應(yīng)，存在活動(dòng)性結(jié)核的可能性大，并結(jié)合其他檢查確定抗結(jié)核治療，在資源有限地區(qū)，為結(jié)核篩查及指導(dǎo)治療的一項(xiàng)經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、簡(jiǎn)單方便的臨床試驗(yàn)。

結(jié)核抗體在結(jié)核診斷方面有一定的參考價(jià)值，患者初次感染結(jié)核后，機(jī)體針對(duì)結(jié)核抗原，出現(xiàn)免疫性抗體，通常實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)核抗體為IgG，說明既往有結(jié)核桿菌感染，若同時(shí)可測(cè)得IgM陽性，表示近期感染結(jié)核桿菌，對(duì)活動(dòng)性結(jié)核診斷意義較大，可有效指導(dǎo)結(jié)核治療，但同樣有一定的假陰性比率，對(duì)結(jié)核抗體陰性的患者，因在2-4周后復(fù)查，并參考其他臨床檢驗(yàn)檢查，綜合判斷是否需要抗結(jié)核治療[2]。

結(jié)核蛋白芯片較敏感、特異性強(qiáng)又純化的抗原為細(xì)胞壁的脂阿拉伯甘露糖(LAM)、16kDa蛋白和38kDa蛋白，可通過檢查該類抗原蛋白發(fā)現(xiàn)結(jié)核感染，尤其對(duì)痰抗酸染色陰性、PPD陰性指導(dǎo)意義更強(qiáng)，但以上蛋白陽性率的出現(xiàn)隨著機(jī)體免疫力的下降升高，通過治療后體內(nèi)水平下降，可能會(huì)造成一定的假陰性，影響臨床判斷，就目前經(jīng)濟(jì)水平，結(jié)核蛋白芯片不在醫(yī)保范圍內(nèi)，門診總共費(fèi)用約150元左右，對(duì)資源有限地區(qū)的篩查及治療參考意義明顯降低。

r-干擾素釋放試驗(yàn)通過結(jié)核桿菌特異抗原ESAT-6以及CFP-10，刺激效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌INF-r，與PPD比較，其最大優(yōu)勢(shì)是，由于刺激的抗原為結(jié)核桿菌所特有，其結(jié)果陽性基本可以排除卡介苗接種或非結(jié)核分枝桿菌感染。檢測(cè)結(jié)果在血樣采集后12至18小時(shí)得出，獲得有意義結(jié)果的幾率均超過96%。在目前開來特異性相對(duì)較高的一種檢測(cè)手段，一方面可以明確結(jié)核感染，同時(shí)基本可以排除非結(jié)核分枝感染感染，這樣大大縮短了等待結(jié)核感染培養(yǎng)結(jié)果出現(xiàn)非結(jié)核分枝桿菌指導(dǎo)臨床的時(shí)間，但也同樣有局限性，就是不能明確是不是活動(dòng)性結(jié)核，并且費(fèi)用較普通痰抗酸染色及PPD試驗(yàn)昂貴，在欠發(fā)達(dá)地區(qū)大面積推廣來替代PPD顯得不太可能。

痰GeneXpert技術(shù)，在一個(gè)密閉的環(huán)境中完成樣品處理、核酸擴(kuò)增、目標(biāo)序列的一系列操作，實(shí)驗(yàn)室要求簡(jiǎn)單，人員技術(shù)要求不高，所需空間小，可對(duì)痰標(biāo)本結(jié)核桿菌基因序列檢測(cè)發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌的存在，并同時(shí)測(cè)81bp明確有無利福平耐藥，理論上講相對(duì)痰抗酸染色是一個(gè)劃時(shí)代的變革和進(jìn)步，逐漸在國(guó)內(nèi)推廣（我院因?yàn)槿蚰退幓蝽?xiàng)目時(shí)有一臺(tái)），同樣其結(jié)果也依賴于痰標(biāo)本的質(zhì)量?jī)?yōu)劣，最主要價(jià)格昂貴，一份檢查500元左右，為自費(fèi)項(xiàng)目，若痰標(biāo)本欠合格，陽性結(jié)果率更低，對(duì)臨床實(shí)際指導(dǎo)意義有限，若能像痰抗酸染色一樣成為常規(guī)檢查，其臨床指導(dǎo)意義超過目前所有結(jié)核病輔助檢查，但基于檢測(cè)試劑的成本問題及當(dāng)?shù)貙?shí)際生活水平，近些年成為常規(guī)檢查的可能性不大。

結(jié)核病的診斷是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的過程，需通過病史、家族或高危環(huán)境密切接觸史、臨床癥狀體征及DR、CT及其他輔助檢查等綜合判斷，是不是結(jié)核病，活動(dòng)與否，該不該治，以上沒有詳細(xì)說明的還有結(jié)核桿菌培養(yǎng)、藥敏檢測(cè)試驗(yàn)等（局部組織結(jié)核病理檢查也受到重視，可借助纖維支氣管鏡、腸鏡、胸腔鏡等取活組織病檢，可有效說明是否結(jié)核感染并可排除腫瘤細(xì)胞可能），因其出結(jié)果時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，一般2-3月左右，在實(shí)際抗結(jié)核治療過程作用有限，但有一定的參考指導(dǎo)意義，抗結(jié)核治療2-3月后，一旦痰結(jié)核桿菌培養(yǎng)出現(xiàn)結(jié)核菌證明結(jié)核活動(dòng)，并可明確有無非結(jié)核分枝桿菌感染，如MAC，遲來的藥敏結(jié)果有部分藥物耐藥，也可以指導(dǎo)臨床更換藥物以修改目前化療方案制定合適方案。

到目前為止，結(jié)核病診斷本身存在困難，尤其有些肺外結(jié)核很難明確診斷，結(jié)核感染的活動(dòng)性評(píng)估仍然是一大難點(diǎn)，并由此出現(xiàn)的結(jié)核病的治療抗與不抗、什么時(shí)候抗、什么時(shí)候停藥等問題依然有諸多的不確定性，在結(jié)核病死灰復(fù)燃的現(xiàn)在，依然面臨很大的挑戰(zhàn)，同時(shí)也存在機(jī)遇，但愿在結(jié)核防治過程中能一一克服障礙，徹底攻破肺結(jié)核及肺外結(jié)核病，還世界一點(diǎn)健康。

（作者單位：武威涼州醫(yī)院武威市傳染病醫(yī)院）

[1]發(fā)達(dá)國(guó)家結(jié)核病控制管理對(duì)我國(guó)的啟示[D].陳鑫銘.江蘇大學(xué)2010.

[2]結(jié)核病?？漆t(yī)院患者規(guī)范診療與信息傳遞干預(yù)試點(diǎn)實(shí)施結(jié)果評(píng)價(jià)[D].劉小秋.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心2011.