●侯君

免疫組化穩(wěn)定表達(dá)與精細(xì)操作

●侯君

若想要使免疫組化實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，需要將免疫組化染色工作做好。進(jìn)行免疫組化染色需要擁有綜合性的染色技術(shù)，在進(jìn)行染色過程中多種因素會(huì)對(duì)染色工作造成影響，所以對(duì)免疫組化染色工作質(zhì)量加以管理并提高染色工作的可信性顯得非常重要。我國(guó)醫(yī)療事業(yè)單位對(duì)免疫組化染色工作開展從21世紀(jì)初開始，經(jīng)過十余年的發(fā)展，對(duì)免疫組化染色工作中的精細(xì)操作已經(jīng)有了非常大的進(jìn)步，本文就將對(duì)精細(xì)操作模式下染色工作質(zhì)量控制各項(xiàng)內(nèi)容，進(jìn)行陳述。

免疫組化;精細(xì)操作;質(zhì)量管理

免疫組化穩(wěn)定表達(dá)是依靠免疫學(xué)中的抗原體反應(yīng)原理，并通過化學(xué)反應(yīng)使對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行定位的顯色劑顯色，以此達(dá)到對(duì)組織細(xì)胞定性以及定量研究目的。因?yàn)檫@項(xiàng)操作處于細(xì)胞層次，所以若想要使免疫組化染色工作能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，就需要對(duì)染色過程中的各步驟進(jìn)行精細(xì)化操作。下文就將對(duì)精細(xì)化操作的各項(xiàng)內(nèi)容進(jìn)行論述。

1 固定標(biāo)本

進(jìn)行染色標(biāo)本固定時(shí)，需要在標(biāo)本離體之后立即進(jìn)行，固定液為10毫升甲醛加上90毫升PBS緩沖液所構(gòu)成濃度為4%的中性緩沖甲醛，固定液的用量要達(dá)到固定標(biāo)本體積的6倍。進(jìn)行標(biāo)本固定時(shí)，無(wú)論是固定時(shí)間過長(zhǎng)或過短，還是固定不穩(wěn)固都會(huì)導(dǎo)致標(biāo)本抗原失去，因此在進(jìn)行固定時(shí)要做到及時(shí)且穩(wěn)固。固定的時(shí)間小標(biāo)本不能小于六個(gè)小時(shí)，腫瘤標(biāo)本則是不能低于24小時(shí)。此外，進(jìn)行淋巴結(jié)及根治標(biāo)本的固定時(shí)要切開。

2 切片、烤片及脫蠟

經(jīng)過固定之后，標(biāo)本要進(jìn)行切片。切片時(shí)需做到切片輕薄且完整，非淋巴組織切片厚度一般為3到4微米，淋巴組織切片為2微米。因?yàn)樵趯?duì)切片若出現(xiàn)褶皺將很難清洗潔凈，會(huì)影響到染色效果，所以要保證切片平整。在進(jìn)行切片清洗時(shí)，容器要潔凈以免產(chǎn)生意外污染，對(duì)閱片造成影響。進(jìn)行烤片時(shí)，溫度要保持在70℃左右，時(shí)間為一到兩小時(shí)。烤片時(shí)溫度以及時(shí)間太長(zhǎng)過高會(huì)使標(biāo)本抗原失去，時(shí)間過短則容易出現(xiàn)脫片現(xiàn)象。烤片之后進(jìn)行脫蠟，脫臘工作不徹底會(huì)導(dǎo)致抗體與抗原之間結(jié)合受到阻擋。進(jìn)行脫蠟時(shí)一般采用松節(jié)油，分為三級(jí)進(jìn)行，每一級(jí)時(shí)間保證在15分鐘左右。松節(jié)油的使用為200片切片進(jìn)行一次更換，這樣能夠保證脫蠟效果良好[1,3]。

3 降低非特異性染色

采用辣根過氧化物酶作為檢測(cè)系統(tǒng)，需在進(jìn)行一抗滴加工作之前，將3%濃度過氧化氫滴加到切片上，保持15分鐘左右進(jìn)行反應(yīng)，將切片組織物中的內(nèi)源性過氧化物酶進(jìn)行消除，以免對(duì)檢測(cè)工作造成干擾。

4 設(shè)立對(duì)照組

進(jìn)行免疫組化染色工作時(shí)，需要設(shè)立對(duì)照組。對(duì)照組的設(shè)立是非常重要的一項(xiàng)工作，設(shè)立對(duì)照組為陽(yáng)性。因?yàn)殛@尾組織中的組織成分較多，包括間質(zhì)、神經(jīng)組織以及淋巴組織和上皮組織等，所以通常會(huì)將闌尾選擇為陽(yáng)性對(duì)照組[2]。

5 恢復(fù)抗原

進(jìn)行抗原修復(fù)時(shí)，有多種方法，包括微波及高壓鍋修復(fù)等方法，在本文中選用高壓鍋修復(fù)法。具體的修復(fù)流程是：首先在高壓鍋內(nèi)放入兩千毫升0.01摩爾每升，ph值為6.0的檸檬酸鹽緩沖液，然后將高壓鍋放到電磁爐上進(jìn)行加熱，直至沸騰。其次，將電磁爐功率換成中檔，然后將切片放到高壓鍋內(nèi)，然后將高壓鍋蓋蓋住，加減壓閥并再次進(jìn)行加熱，當(dāng)高壓鍋開始冒氣再維持兩分鐘，然后再熄火并進(jìn)行冷卻。采用高壓鍋法進(jìn)行抗原修復(fù)，擁有受熱及壓力穩(wěn)定和切片背景著色淡的好處。除此之外，進(jìn)行核染色陽(yáng)性抗原修復(fù)時(shí)，最好的方法是采用ph值為9.0的EDTA修復(fù)液，胞質(zhì)及胞膜染色陽(yáng)性抗原修復(fù)也采用上述修復(fù)液，但ph值為8.0。

6 顯色

若已經(jīng)完成配置的DAB顯色液底部有棕色沉淀物，那么此顯色液可能已經(jīng)沒有效果，最好的辦法就是重新進(jìn)行顯色液配制。在進(jìn)行顯色時(shí)，顯色效果快速的位置是大范圍陽(yáng)性分布或者是胞質(zhì)組織有陽(yáng)性定位的部位。相反的部位，在進(jìn)行顯色時(shí)觀察效果不明顯，所以需要依靠顯微鏡。進(jìn)行顯色觀察時(shí)，時(shí)間要掌握好不能過長(zhǎng)，否則很容易使背景染色，對(duì)顯色效果造成影響。

7 復(fù)染

為了能夠使切片的陽(yáng)性染色顯色效果達(dá)到最優(yōu)，需要進(jìn)行復(fù)染操作。因?yàn)檫M(jìn)行切片的復(fù)染操作主要是為了使顯色達(dá)到更好效果，所以蘇木精的顏色應(yīng)盡量保持清淡。而且在進(jìn)行復(fù)染操作時(shí)，還須要用到吸附玻片，所以要對(duì)蘇木精進(jìn)行及時(shí)的過濾，避免因?yàn)槿藶橐蛩囟斐杀尘氨蝗旧瑢?duì)免疫組化染色顯色觀察效果造成嚴(yán)重影響[4]。

8 染色細(xì)節(jié)

在進(jìn)行免疫組化染色操作時(shí)，需要注意以下幾個(gè)方面。首先，因?yàn)闃?biāo)本切片一旦干燥，就會(huì)使切片內(nèi)部的抗原因失去水分而流失，這種情況會(huì)對(duì)后續(xù)的染色以及顯色工作造成嚴(yán)重影響，因此在整個(gè)染色過程中要確保切片能夠保持濕潤(rùn)，以此保證免疫組化染色質(zhì)量。其次，則是在進(jìn)行一抗的滴加時(shí)，切片上的多余水分會(huì)使抗體被稀釋，所以要將切片上的水分進(jìn)行清除。而且在進(jìn)行抗體滴加時(shí)，要保證滴加的范圍能夠?qū)⑺薪M織都囊括進(jìn)去，避免出現(xiàn)邊緣部位沒有覆蓋到抗體，出現(xiàn)邊緣效應(yīng)現(xiàn)象。此外，在進(jìn)行一抗滴加時(shí)要保證孵育盒的放置角度水平，以免在進(jìn)行抗體的滴加時(shí)抗體從組織切片的一端流向另一端，避免后續(xù)的染色顯色結(jié)果出現(xiàn)假陰性亦或是部分弱陽(yáng)性，降低染色工作效果，增加工作時(shí)間[5]。

9 結(jié)束語(yǔ)

結(jié)合上述論述內(nèi)容，我們可以發(fā)現(xiàn)想要使免疫組化染色質(zhì)量控制工作效果達(dá)到最優(yōu)，需要將各項(xiàng)控制措施在實(shí)驗(yàn)檢測(cè)之前進(jìn)行實(shí)施，例如對(duì)標(biāo)本及切片的處理工作。在免疫組化染色操作流程中，各項(xiàng)工作之間都會(huì)產(chǎn)生影響，而且這種影響是非常嚴(yán)重的。所以對(duì)于各項(xiàng)操作流程要嚴(yán)格按照順序進(jìn)行，并對(duì)每一個(gè)步驟內(nèi)的操作進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)督與控制，只有這樣才能使切片以及標(biāo)本質(zhì)量達(dá)到最優(yōu)，為后續(xù)的染色及顯色工作奠定良好基礎(chǔ)。在進(jìn)行操作時(shí)，工作人員需具有高度責(zé)任感，并且擁有嫻熟的操作技術(shù)，嚴(yán)格按照要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

(作者單位：河北省眼科醫(yī)院病理科)

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