周穎，李鑫

1.南關(guān)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，吉林長(zhǎng)春 130041；2.長(zhǎng)春市食品藥品監(jiān)督管理局食品稽查分局，吉林長(zhǎng)春 130000

食品中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法淺析

周穎1，李鑫2

1.南關(guān)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，吉林長(zhǎng)春 130041；2.長(zhǎng)春市食品藥品監(jiān)督管理局食品稽查分局，吉林長(zhǎng)春 130000

金黃色葡萄球菌在自然界中有著十分廣泛的分布，能造成食品污染以及細(xì)菌性食物中毒，因此在食品檢測(cè)中必須重點(diǎn)關(guān)注金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。目前，金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法主要包括反向膠乳凝結(jié)法、PCR法、酶聯(lián)免疫吸附法等，檢測(cè)人員必須深入了解金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性、流行病學(xué)特點(diǎn)、致病性等才能保證檢測(cè)的順利進(jìn)行。

金黃色葡萄球菌；葡萄球菌腸毒素；檢測(cè)方法

隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，人們的生活水平逐漸提升，對(duì)食物的要求也越來(lái)越高。近些年，食品安全問(wèn)題引起了公眾的廣泛重視，相關(guān)部門(mén)必須做好食品檢測(cè)工作，努力提高食品檢測(cè)技術(shù)水平，保障食品安全。金黃色葡萄球菌是一種人畜共患病的重要致病菌，在特定的生長(zhǎng)條件下，金黃色葡萄球菌能夠合成金黃色葡萄球菌腸毒素，食用含有金黃色葡萄球菌的食物會(huì)出現(xiàn)食物中毒現(xiàn)象，這給人們的身體健康造成了很大威脅。

1 金黃色葡萄球菌簡(jiǎn)介

1.1 金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性

金黃色葡萄球菌的別名是“金葡菌”，沒(méi)有芽胞和鞭毛，大多數(shù)細(xì)菌沒(méi)有莢膜。金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁由肽聚糖和磷壁酸組成，兩者比例為9:1，肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)要比革蘭氏陰性菌更為致密，因此革蘭染色呈現(xiàn)陽(yáng)性。金黃色葡萄球菌屬于需氧或兼性厭氧菌，對(duì)培養(yǎng)條件沒(méi)有很高的要求，在普通培養(yǎng)基上就可以健康生長(zhǎng)，菌落呈現(xiàn)圓形凸起，厚且有光澤，直徑約為0.5～1.0 mm，生長(zhǎng)適宜溫度為37℃，適宜pH值為7.4。金黃色葡萄球菌具有較好的耐鹽性和抵抗力，在干燥的環(huán)境中可以存活幾周，能夠分解葡萄、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，對(duì)青霉素、紅霉素等高度敏感。Barber在1914年首先發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌導(dǎo)致食物中毒與其產(chǎn)生的有毒物質(zhì)有關(guān)，Verwry于1940年發(fā)現(xiàn)了金葡菌腸毒素蛋白A，目前，金葡菌腸毒素B、C、D、E和F免疫學(xué)型的外毒素等都已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)[1]。

1.2 金黃色葡萄球菌的流行病學(xué)特點(diǎn)

金黃色葡萄球菌幾乎無(wú)處不在，因此很容易造成食品污染，發(fā)生食物中毒的食品種類(lèi)多種多樣，主要包括肉、蛋、奶魚(yú)及其制品，剩飯、涼粉等引起食物中毒也有先例。在美國(guó)，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的1/3以上，加拿大由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒約占細(xì)菌性食物中毒的一半，我國(guó)也發(fā)生多起此類(lèi)事件。金黃色葡萄球菌腸毒素是金黃色葡萄球菌所引起的食物中毒現(xiàn)象的主要致病因子，這一致病因子呈現(xiàn)季節(jié)性分布，結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，在食物加熱過(guò)程中會(huì)保持活性甚至活性增加。金黃色葡萄球菌腸毒素是一個(gè)世界性的難題，能夠引起人畜共患病，由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的疾病包括化膿感染、肺炎、心包炎等，嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致敗血癥、膿毒癥等，后果十分嚴(yán)重。金黃色葡萄球菌腸毒素可以通過(guò)以下途徑污染食品：①食品加工人員、炊事員等攜帶金黃色葡萄球菌而造成食品污染；②食品在加工之前已經(jīng)感染金黃色葡萄球菌或者在加工過(guò)程中受到污染，產(chǎn)生了腸毒素；③熟食制品由于包裝不嚴(yán)等原因遭受污染；④奶牛患化膿性乳腺炎或者出現(xiàn)局部化膿現(xiàn)象，從而污染了肉體。

1.3 金黃色葡萄球菌的致病性

金黃色葡萄球菌的致病能力強(qiáng)弱由其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶決定，殺白細(xì)胞素能夠破壞人體的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致人體免疫能力下降；溶血毒素是一種外毒素，分為4種類(lèi)型，能夠破壞人和動(dòng)物體內(nèi)的血小板，損傷溶酶體，導(dǎo)致人和動(dòng)物體內(nèi)出現(xiàn)局部缺血和肌體壞死等現(xiàn)象；脫氧核糖核酸酶具有良好的耐熱性，可以做為金黃色葡萄球菌檢測(cè)的重要依據(jù)之一；血漿凝固酶可以阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬作用，引起局部感染；金黃色葡萄球菌是一種侵襲性細(xì)菌，侵入人和動(dòng)物體內(nèi)后可以產(chǎn)生多種腸毒素，引起急性胃腸炎等，對(duì)腸道具有極大的破壞作用，這些腸毒素能夠耐高溫，一般的高溫殺菌方法無(wú)法破壞腸毒素的結(jié)構(gòu)。金黃色葡萄球菌腸炎一般中毒癥狀嚴(yán)重，患者會(huì)出現(xiàn)嘔吐、發(fā)熱、腹瀉的現(xiàn)象，發(fā)病很急。

2 金黃色葡萄球菌的常規(guī)檢測(cè)分析方法

2.1 反向乳膠凝結(jié)法（RPLA）檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素

反向乳膠凝結(jié)法的直接檢出物是金黃色葡萄球菌腸毒素，由于金黃色葡萄球菌在特定條件下能夠生成腸毒素，因此該方法可以間接判斷金黃色葡萄球菌的存在。反向乳膠凝結(jié)法的原理是凝集反應(yīng)，當(dāng)待測(cè)樣本中含有腸毒素，免疫球蛋白IgG包埋的乳膠顆粒結(jié)合血漿纖維蛋白原會(huì)和凝血因子發(fā)生反應(yīng)，生成沉淀。反向乳膠凝結(jié)法可以檢測(cè)4種金黃色葡萄球菌腸毒素：SEA，SEB，SEC以及SED，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)明顯，檢測(cè)效果值得肯定。但是，反向乳膠凝結(jié)法要使用專(zhuān)用的試劑，檢測(cè)成本比較高，不同批次的試劑可能存在些微的性能差異，這也許會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響[2]。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素

酶聯(lián)免疫吸附法十分快捷，檢測(cè)效率高。該方法將已知的抗原與抗體吸附在固相載體的表面，使酶標(biāo)記的抗原與抗體之間的特異性免疫反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，通過(guò)酶促反應(yīng)的放大作用來(lái)顯示初級(jí)免疫反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附法的靈敏度很高，檢測(cè)范圍在ng和pg水平，準(zhǔn)確度很高，能夠直接檢測(cè)溶液中的腸毒素，因此一次行可以對(duì)大量的樣品進(jìn)行處理，檢測(cè)速度快，適合用于定性試驗(yàn)篩選，值得基層推廣。但是酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)試劑的選擇性較高，不能夠同時(shí)分析多種成分，而且它使用的試劑均為生物制劑，因此穩(wěn)定性不高，產(chǎn)品的性能可能存在差別，從而影響測(cè)試效果。

2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素

伴隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR技術(shù)以及基因芯片技術(shù)等在諸多領(lǐng)域發(fā)揮了重要的作用。運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)來(lái)檢測(cè)金黃色葡萄球菌具有速度快、結(jié)果可靠、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，相比于其他檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏性和檢測(cè)速度有了明顯提高。但是在食品加工過(guò)程中，高溫和化學(xué)處理會(huì)破壞金黃色葡萄球菌的DNA，從而影響PCR檢測(cè)的靈敏度，食品基質(zhì)、殘留食物成分等也會(huì)對(duì)PCR檢測(cè)過(guò)程造成抑制作用，使其無(wú)法順利進(jìn)行，此外，PCR能夠擴(kuò)增已死亡的金黃色葡萄球菌的DNA，因此可能造成假陽(yáng)性的結(jié)果。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)對(duì)試驗(yàn)技術(shù)的要求比較高，需要較多的資金支持，這限制了它在食品檢測(cè)中的應(yīng)用。

3 金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)分析方法

3.1 熒光酶標(biāo)免疫分析儀（VIDAS）檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素

熒光酶標(biāo)免疫分析儀（VIDAS）使用的檢測(cè)方法是熒光酶標(biāo)免疫分析法（ELFIA）。ELFIA的原理是使待測(cè)樣本中的抗原和抗體進(jìn)行結(jié)合，然后在待測(cè)樣本中添加酶反應(yīng)的底物，使其在酶的催化作用之下生成帶熒光標(biāo)記的產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與待測(cè)樣本的量成正相關(guān)，因此可以根據(jù)產(chǎn)物的熒光程度進(jìn)行定性和定量分析。這種方法建立在酶催化的基礎(chǔ)上，反應(yīng)可能存在一些不穩(wěn)定性，從而造成假陽(yáng)性的結(jié)果。使用VIDAS檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化與智能化，在檢測(cè)過(guò)程中，從待測(cè)樣本的清洗一直到最后分析報(bào)告的生成都交由電腦控制，檢測(cè)效率高，操作方便。VIDAS的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，它在檢測(cè)過(guò)程中設(shè)置了樣本對(duì)照組，因此系統(tǒng)可以自動(dòng)排除非特異性熒光，提高了檢測(cè)精度，保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。使用VIDAS可以進(jìn)行多種金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測(cè)，但是無(wú)法進(jìn)行腸毒素分型。

3.2 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）檢測(cè)金黃色葡萄球菌

傅里葉變換紅外光譜法，顧名思義，是要檢測(cè)樣本的紅外光譜，通過(guò)光譜特性來(lái)判定物質(zhì)的存在與否。一些學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，微生物的紅外譜圖之間存在差異，這些差異主要表現(xiàn)在微生物分析靈敏區(qū)內(nèi)的峰形、峰位、峰數(shù)以及峰強(qiáng)等方面，研究結(jié)果與傅里葉變換紅外光譜法的思想一致。使用FTIR檢測(cè)金黃色葡萄球菌首先要把金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)洗脫，然后接受傅里葉變換紅外光譜儀掃描，得到紅外光譜圖。通過(guò)多種分析方法來(lái)分析紅外光吸收?qǐng)D譜的特征，尋找金黃色葡萄球菌的特征譜峰和圖譜帶便可以判斷金黃色葡萄球菌的存在與否。利用FTIR法檢測(cè)金黃色葡萄球菌，事先并不需要對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行處理，因此不會(huì)對(duì)食品造成污染，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快。但是，F(xiàn)TIR法是一種間接分析技術(shù)，需要依賴(lài)事先確定的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)則，檢測(cè)靈敏度較低。

3.3 基質(zhì)輔助激光解吸—電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOF-MS）法

MALDI-TOF-MS法首先要使樣品和基質(zhì)在靶盤(pán)上形成共結(jié)晶，然后用脈沖激光照射，基質(zhì)分子吸收能量之后會(huì)與樣品解吸附，并使其發(fā)生電離。樣品離子在加速電場(chǎng)下將獲得動(dòng)能，經(jīng)過(guò)高壓加速、聚焦后，利用飛行時(shí)間檢測(cè)器進(jìn)行質(zhì)量分析，可以發(fā)現(xiàn)，樣品離子的質(zhì)荷比與離子飛行時(shí)間的平方成正比，由此可通過(guò)飛行時(shí)間確定離子的質(zhì)荷比，然后再進(jìn)一步對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量分析。利用基質(zhì)輔助MALDI-TOF-MS法檢測(cè)金黃色葡萄球菌時(shí)要將腸毒素當(dāng)作金黃色葡萄球菌的特征性生物標(biāo)志物，再基質(zhì)輔助下檢測(cè)樣品點(diǎn)樣，得到包含腸毒素分子量及其結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜圖，比較腸毒素的質(zhì)譜圖與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)中的質(zhì)譜圖，陽(yáng)性則表示食品中含有金黃色葡萄球菌。MALDI-TOF-MS法檢測(cè)速度快，靈敏度高，具有很高的分辨率，同時(shí)，該方法對(duì)樣本的要求很低，不需要分離被檢物中的污染微生物便可以直接分析其特征性生物標(biāo)志蛋白，有助于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)。

4 結(jié)語(yǔ)

金黃色葡萄球菌廣泛分布在空氣、水、塵埃以及人和動(dòng)物的排泄物當(dāng)中，其在特定條件下合成的金黃色葡萄球菌腸毒素會(huì)造成食物中毒。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法經(jīng)歷了從傳統(tǒng)免疫學(xué)方法到PCR技術(shù)以及基因芯片技術(shù)等的發(fā)展歷程，檢測(cè)速度和檢測(cè)靈敏度都有了明顯提升。在未來(lái)，金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法將會(huì)朝著微量化、自動(dòng)化方向發(fā)展，會(huì)在食品安全保護(hù)中起著至關(guān)重要的作用。

[1]陸貞玉.食品中金黃色葡萄球菌及檢測(cè)方法現(xiàn)況[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志,2010,26(11):892-894.

[2]劉海卿,佘之蘊(yùn),陳丹玲.金黃色葡萄球菌三種定量檢驗(yàn)方法的比較[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2014,35(13):113-115.

R93

A

1672-5654（2017）02（c）-0041-02

2016-11-25）

周穎（1971.11-），女，吉林長(zhǎng)春人，本科，副主任檢驗(yàn)技師，研究方向：衛(wèi)生檢驗(yàn)。

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.06.041