高松紅

長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林長春 130031

現(xiàn)代藥物分析包括鑒別、檢查、含量檢測(cè)和對(duì)藥物質(zhì)量進(jìn)行靜態(tài)控制，研究范圍涵蓋藥物研制和使用的所有流程，藥物分析在藥物的研究、開發(fā)、制備、生產(chǎn)中起著不可或缺的作用，現(xiàn)代藥物分析常用的技術(shù)主要涉及光譜、色譜和質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)。藥物分析要求運(yùn)用不同的檢測(cè)手段，完成對(duì)藥物分子定量定性的研究。

1 光譜、波譜相關(guān)技術(shù)

1.1 光譜相關(guān)

紫外線光譜、熒光光譜和化學(xué)發(fā)光都屬于光譜相關(guān)的藥物檢測(cè)技術(shù)，其中最常用的是紅外光譜和拉曼光譜，他們廣泛應(yīng)用于藥物的含量測(cè)定、水分測(cè)定、結(jié)晶行為、組成均勻度和固態(tài)的物理化學(xué)性質(zhì)相關(guān)的表征。近紅外光譜波長在0.75~2.5 nm間，具有快速、無損、強(qiáng)度弱、吸收峰相互重疊的特點(diǎn)，可用于多種組分的同時(shí)檢測(cè)，高光譜分離的近紅外有幾十微米的分辨率，是識(shí)別假藥成分的有效方法，近紅外光譜是利用分子中C—H,O—H,N—H鍵的倍頻及合頻振動(dòng)所產(chǎn)生的吸收光譜分析、鑒別藥物成分。紅外光譜得到的結(jié)果要聯(lián)合聯(lián)合化學(xué)計(jì)量學(xué)途徑進(jìn)行分析，通過偏最小二乘法、主成分分析法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法等犯法建立數(shù)學(xué)模型，進(jìn)而對(duì)藥物成分進(jìn)行準(zhǔn)確的分析。遠(yuǎn)紅外光譜波長在25~1 000 nm，不僅可以用于檢測(cè)多晶型的純度，還能用于確定蛋白質(zhì)的構(gòu)象、考察藥物組分的均勻度等，在定量分析方面具有強(qiáng)容錯(cuò)性、高可信度的特點(diǎn)。拉曼光譜是散射光譜，它通過分子的振動(dòng)與轉(zhuǎn)動(dòng)研究分子的機(jī)構(gòu)，具有穿透力強(qiáng)、樣品容量少、信息獲取途徑多、硬件易攜帶的特點(diǎn)主要用于鑒別實(shí)驗(yàn)和結(jié)構(gòu)解析，最新的用于藥物分析的拉曼光譜有共振拉曼光譜、表面增強(qiáng)拉曼光譜和傅立葉變換表面增強(qiáng)拉曼光譜等，共振拉曼光譜是通過信號(hào)增強(qiáng)效應(yīng)達(dá)到藥物分析的目的，空間位移拉曼光譜可以直接通過外包裝對(duì)藥物進(jìn)行鑒別，NIR光譜儀是當(dāng)前拉曼光譜技術(shù)的主要儀器，它用于分析藥物配方中的活性成分，與拉曼光譜技術(shù)聯(lián)合能高效鑒定藥物的真假。另外，還有熒光光譜和化學(xué)發(fā)光等技術(shù)，它們的優(yōu)勢(shì)在于高靈敏度和高特異性，可以應(yīng)用于多種藥物成分的同時(shí)定性定量的分析。

1.2 色譜相關(guān)

色譜方法具有普遍具有快速、穩(wěn)定、高效的優(yōu)點(diǎn)，它利用藥物中各成分在某一物質(zhì)中的吸附或溶解性能的不同，或和其他親和作用性能的差異，使混合物流經(jīng)該種物質(zhì)，其原理與化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的萃取有些相似。色譜法對(duì)樣品預(yù)處理的要求不高，目前廣泛應(yīng)用于藥品分析中。色譜分析可以大致分為薄層色譜法、液相色譜、氣相色譜、固相色譜等。薄層色譜是將被分離的溶液點(diǎn)在專用薄層板的一段，用溶劑將試樣分開，薄層色譜系統(tǒng)耐用性良好、靈敏度高，檢測(cè)樣品速度快，是快速分離和定量分析藥品的重要技術(shù)，薄層色譜法可以檢測(cè)中保健品中的非法的雙胍類成分，與拉曼光譜聯(lián)用可以檢測(cè)中草藥中的結(jié)構(gòu)類似物、血液中的嗎啡等。液相色譜法應(yīng)用范圍極為廣泛，它以液體溶劑作為流動(dòng)相，實(shí)現(xiàn)藥物的快速分離，普遍應(yīng)用于原料藥生產(chǎn)和制備過程。高速逆流色譜是液相色譜中最先進(jìn)最常用的技術(shù)，它的優(yōu)點(diǎn)是不需要固相載體、操作快捷、樣品回收率高，它可以用于小量分析和規(guī)模純化，HSCCC廣泛應(yīng)用于天然植物活性成分藥物的分離，在可以應(yīng)用于有機(jī)酸、生物堿、香豆素、植物多酚等幾乎所有的天然植物化學(xué)成分的分離，所以天然產(chǎn)物的粗提物的提純一般都用HSCCC，經(jīng)實(shí)踐，使用高速逆流色譜對(duì)藥物進(jìn)行提純純度可以達(dá)到90%以上。氣相色譜具有高效快速的分離特性，適用于揮發(fā)性組分分析和殘留溶劑的檢測(cè)，應(yīng)用最廣泛的是反相模式。近些年來，氣相色譜研發(fā)出了親水作用色譜、疏水作用色譜等。目前色譜的研究集中于使用整體柱或小孔徑填料色譜柱以減低樣品分析時(shí)間，達(dá)到快速高效的目的，在超高壓液相色譜中可根據(jù)耐受氣壓選擇色譜柱，最高可選擇1.5 nm及3 nm孔徑的色譜柱，研究難度在于超高壓力條件下液體可壓縮性會(huì)引起液體的非線性升溫，溫度的變化難以控制給方法開發(fā)增加了難度。

1.3 質(zhì)譜相關(guān)

近些年來，適用于大氣壓下直接離子化的質(zhì)譜表面分析技術(shù)（又稱MS）方興未艾，目前質(zhì)譜相關(guān)的藥物分析技術(shù)主要有噴霧解吸電離和實(shí)時(shí)直接分析2種，利用這些技術(shù)可以省略樣品處理步驟，方法的適用性較強(qiáng)。MS可以進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)的快速分析，幾秒鐘內(nèi)便可獲得結(jié)果。使用大氣壓下超聲噴霧分析藥物組分，只需要氮?dú)饣蚩諝庾鲚o助，操作和條件都很簡(jiǎn)單,而且使用面解吸大氣壓化學(xué)電離結(jié)合PCA法能成功測(cè)出復(fù)雜藥品的物質(zhì)組成、活性成分、質(zhì)譜指紋譜信息和制備工藝等，無需對(duì)藥品進(jìn)行提前處理就可以準(zhǔn)確的追蹤到其來源，這種方法在檢驗(yàn)藥物的真?zhèn)畏矫嬗袕V泛的應(yīng)用。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將色譜的分離能力與質(zhì)譜的高選擇性結(jié)合在一起，與傳統(tǒng)檢測(cè)器相比，它可以得到藥品的更多信息，主要應(yīng)用在代謝產(chǎn)物、天然藥物和殘留物的成分分析。在藥物分析中，質(zhì)譜起到了色譜的選擇器的作用，極大的提高了色譜的鑒定能力，在生物藥品的測(cè)定中有很大的優(yōu)勢(shì)，最近，Zhu等采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的方法成功測(cè)出人體血液中的各種成分，定量分析了血液中的米力農(nóng)，而色譜所用的時(shí)間僅有3 min，同樣是應(yīng)用UPLC-MS/MS方法，Micˇová等將其與 FIA2方法結(jié)合測(cè)定了白血病患者血液中的伊馬替尼，不精確度低于5.7%,回收率大于93%，顯示出高一致性。在藥物代謝研究中，使用LC-MS法可以避免繁雜的分離樣品的步驟，能節(jié)省大量的時(shí)間和精力，藥物代謝研究中常用的方法是多反應(yīng)監(jiān)測(cè)和碰撞誘導(dǎo)解離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)可以有效提高檢測(cè)的靈敏度，碰撞誘導(dǎo)解離能打碎樣品的分子離子，進(jìn)而通過各種方法對(duì)其進(jìn)行掃描，可以得出代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，研究表明，通過UPLC-MS/MS法，可以高效快速的分離中藥單體及其代謝產(chǎn)物，結(jié)合負(fù)離子ESI-MS圖譜可以分析出代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式。在殘留藥物成分鑒定分析方面，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法將人們對(duì)殘留藥物定量分析的下限一再提高，可以準(zhǔn)確的分析出ng級(jí)和pg級(jí)的殘留藥物的成分和結(jié)構(gòu)，Xia等利用UPLC-MS/MS法成功測(cè)定出牛奶中的苯并咪唑類殘留物，整個(gè)分離過程僅用了 8 min，且定量范圍在 0.01～0.5 μg/mL 之間，展現(xiàn)出極高的靈敏度。

2 其他方法

2.1 時(shí)間分辨熒光分析法

時(shí)間分辨熒光分析法是以具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合劑作為示蹤物，建立的一種新型的非放射性微量分析技術(shù)。它是近些年研發(fā)的最靈敏的微量分析技術(shù)，通過適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光源和檢測(cè)體系，利用鑭系元素及其螯合物的發(fā)光特性分辨各種藥物成分。時(shí)光分辨熒光分析法的基礎(chǔ)是FIA，與EIA法、CLIA法不同的是，螯合物的熒光波長與激發(fā)波長的差異使雜色光很容易被分辨出來，光電接收器與激發(fā)光的分離使分析結(jié)果的精確度大大提高，在需要超微量分析的時(shí)候，時(shí)間分辨熒光分析法最大程度上減小了激發(fā)光的雜色光對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，與普通光學(xué)分析方法相比靈敏度有明顯的提高。時(shí)光分辨熒光分析法的靈敏度在10~18 mol/well(Eu3+)之間，線性度為（10~18）~（10~12）mol/well(Eu3+)，其標(biāo)記離子的熒光激發(fā)光波長范圍寬于一般光學(xué)分析方法，發(fā)射光譜峰范圍則較窄，可以有效的增加熒光強(qiáng)度，提高各類熒光的分辨率，進(jìn)而提高藥物成分的分析效率和精確度?；谄淇蛇M(jìn)行多標(biāo)記、特異性高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好的特點(diǎn)，時(shí)間分辨熒光免疫分析可以應(yīng)用于甲狀腺激素、甾體類激素、病毒性肝炎標(biāo)志物、腫瘤相關(guān)抗原、多肽類藥物等的分析。

2.2 生化藥物分析中應(yīng)用的技術(shù)

生化藥物大致可以分為多肽類、酶類和單克隆抗體3種。目前已有多種對(duì)多肽類藥物進(jìn)行檢測(cè)分析的方法Wang等通過金屬螯合物親和色譜和陽離子交換色譜純化，經(jīng)MALDI-TOFTOF-MS確定藥物分子量，并結(jié)合基因組學(xué)等昂法確定了多肽類藥物中的氨基酸殘基類型；劉永福等構(gòu)建了Tricine-SDS-PAGE和LC-MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方法，用于定量測(cè)定多肽和蛋白質(zhì)；李萍等通過質(zhì)譜檢測(cè)和溴化氰裂解蛋白質(zhì)C末端方法檢測(cè)出了多肽類藥物的全部C末端。對(duì)于酶類藥物，最近毛歆等建立了測(cè)定注射用降纖酶中降纖酶的高效液相色譜分析方法；Liu等建立了凝膠電泳和輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜法，測(cè)定酶類藥物純度達(dá)到98%。單克隆抗體藥物分析較多肽類藥物更為復(fù)雜，因此其分析研究系統(tǒng)需要更完善，最近畢華等通過HUVEC增殖抑制試驗(yàn)、SDS-PAGE、SEC-HPLC、胰酶酶切和 HPLC、定量 PCR、ELISA、水平等電聚焦電泳等方法建立了VEGF單抗的質(zhì)控方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 中藥分析技術(shù)

中藥多組分同時(shí)分離分析技術(shù)是有多種多種方法和技術(shù)的整合為以多組分為研究對(duì)象的中藥分析技術(shù)，HILICTOF-MS與RPLC-TOF-MS相結(jié)合、HPLC-TOF-MS法、(HPLC-LTQ-Orbitrap-MS、HPLC-MS、GC-MS、 柱切換技術(shù)等都是目前中藥組分分離分析常用的方法；中藥指紋圖譜技術(shù)是通過聯(lián)用技術(shù)對(duì)中藥組分詳細(xì)準(zhǔn)確的組分含量和鑒別分析的技術(shù)，目前最新的技術(shù)有HPLC-DAD法、LCDAD-MS/MS法、UPLC-光電二極管陣列檢測(cè)器（PDA）技術(shù)等；中藥體內(nèi)過程研究大多采用色譜及其聯(lián)用技術(shù)，因?yàn)樗哂徐`敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，HPLC、UPLC-MS、HPLCMS、GC-MS、HPLC-Q-Trap、UPLC-Q/TOF-MS 以及HPLC-TOF和HPLC-Q-IT結(jié)合的方法都是中藥體內(nèi)研究的常用的方法；中藥品質(zhì)控制和鑒別是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的重要環(huán)節(jié)，因此，中藥品質(zhì)控制和鑒別的研究一直是中藥分析的重要部分，HPLC、GC、HPCE及相應(yīng)的聯(lián)用技術(shù)、DART-MS技術(shù)、NIR光譜法等在中藥品質(zhì)控制與鑒別中都有重要的地位。

3 結(jié)語

藥物分析水平的不斷提高推進(jìn)了藥物研發(fā)、制備的進(jìn)程，隨著藥物分析方法的不斷進(jìn)步，新技術(shù)和新設(shè)備逐漸被用于藥物分析，更先進(jìn)的藥物分析技術(shù)水平和更微型化、集成化、智能化的儀器設(shè)備的應(yīng)用使藥物分析越來越快速、準(zhǔn)確，藥物分析的發(fā)展為創(chuàng)新藥物的研究、開發(fā)和研究使藥物的安全性、有效性有了更高的保障，并進(jìn)一步促進(jìn)了藥物科學(xué)的進(jìn)步。

[1]張禎，劉景富，姚焱，等.競(jìng)爭(zhēng)雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫分析法同時(shí)測(cè)定豬肉組織中氯霉素和萊克多巴胺研究[J].科學(xué)通報(bào)，2011，56（4-5）：304-308.

[2]吉飛躍，錢開成，崔益祥.時(shí)間分辨熒光分析法檢測(cè)低值乙型肝炎病毒表面抗原的質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].分子診斷與治療雜志，2012，4（5）：329-332