王衛(wèi)國(guó)，胡曉偉

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

葡萄酒中多酚及多酚氧化酶研究現(xiàn)狀與展望

王衛(wèi)國(guó)，胡曉偉

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

葡萄酒富含多種營(yíng)養(yǎng)與保健成分，具有預(yù)防心腦血管疾病、抗氧化、抗菌、抗癌、助眠等保健功效，葡萄酒中多酚類物質(zhì)因具有極強(qiáng)的抗氧化、抗菌與預(yù)防心腦血管疾病等生理藥理活性而倍受人們推崇，但多酚氧化酶會(huì)氧化破壞葡萄酒中的多酚，不僅會(huì)使葡萄酒變色變質(zhì)變味，還會(huì)使其營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值明顯降低。對(duì)葡萄酒中的多酚以及多酚氧化酶進(jìn)行深入研究不僅有利于優(yōu)質(zhì)葡萄酒的研發(fā)與生產(chǎn)，還將為相關(guān)食品藥品與果酒科學(xué)的研究提供借鑒。該文主要對(duì)目前國(guó)內(nèi)外對(duì)葡萄酒中多酚及多酚氧化酶的種類、制備方法、酶活測(cè)定方法、酶活的影響因素等內(nèi)容的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了概述，并對(duì)有待加強(qiáng)的研發(fā)內(nèi)容及其前景進(jìn)行了展望。

葡萄酒；多酚；多酚氧化酶；研究現(xiàn)狀；展望

葡萄酒含有大量對(duì)人體有益成分，且富含具有抗氧化等作用的多酚類物質(zhì)。但葡萄酒中多酚氧化酶的存在，嚴(yán)重破壞了葡萄酒中的多酚，這樣不僅使葡萄酒中的多酚類物質(zhì)含量大幅度降低，還會(huì)使葡萄酒變色變質(zhì)變味，不僅使其營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值明顯降低，甚至使其喪失商品性。因此，葡萄酒中多酚及多酚氧化酶的深入研究不僅對(duì)葡萄酒的研發(fā)生產(chǎn)及其保健功效的推廣應(yīng)用具有重要意義，還將為相關(guān)食品藥品與果酒科學(xué)的研究提供借鑒。本文主要對(duì)目前國(guó)內(nèi)外葡萄酒中多酚及多酚氧化酶的種類、制備方法、酶活測(cè)定方法、酶活的影響因素等內(nèi)容的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了概述，并對(duì)有待加強(qiáng)的研發(fā)內(nèi)容及其前景進(jìn)行了展望。

1 葡萄酒中的多酚類物質(zhì)

多酚類化合物是含有多個(gè)酚性羥基和芳香族基團(tuán)的一類物質(zhì)[1]，自然界中有超過(guò)6 500種的多酚或酚類化合物及其衍生物，存在于植物果實(shí)或果蔬中的多酚，是人類每天從食物中攝入的抗氧化物質(zhì)中數(shù)量最多的一類[2]。多酚類化合物不但具有優(yōu)良的抗氧化功能，還具有強(qiáng)化血管壁彈性、促進(jìn)腸胃消化、降血脂、提高人體免疫力、預(yù)防動(dòng)脈硬化以及血栓形成的作用，同時(shí)也能抑制細(xì)菌與癌細(xì)胞生長(zhǎng)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄酒中含有超過(guò)50種多酚化合物，是葡萄酒中種類最多的抗氧化物質(zhì)，包括單寧、原花青素、花青素、白藜蘆醇等[5-8]。由于葡萄酒多酚化合物所包含的化合物類型比較多，不是單一成分，所以它所發(fā)揮的作用自然高于單一成分的功效[9]。上述幾大類葡萄酒中的多酚類物質(zhì)的研發(fā)現(xiàn)狀概述如下。

1.1 單寧

單寧又名單寧酸，在藥典上又被稱為鞣質(zhì)或鞣酸，是由一些非?；钴S的基本分子通過(guò)縮合或聚合作用形成的一類復(fù)雜高分子多元酚類化合物。1962年，單寧被定義為能夠沉淀生物堿、明膠及其他蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為500～3000Da的水溶性多酚化合物[10]。根據(jù)單寧化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，可將葡萄酒中的單寧分為水解單寧和縮合單寧[11-12]。常溫下單寧為淡黃色至淺棕色粉末，有特殊氣味，味極澀，溶于水、丙酮、乙醇，不溶于乙醚和氯仿。容易吸潮，在空氣中易氧化使其顏色加深，本身毒性很低[13]。單寧的各種性質(zhì)，包括自由基清除能力和蛋白質(zhì)結(jié)合能力等，主要取決于其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，尤其是聚合度大小[14]。雖然人們對(duì)單寧的認(rèn)識(shí)和研究已有較長(zhǎng)時(shí)間，商業(yè)上亦常宣傳葡萄酒中的單寧對(duì)于健康的重要性，但由于人們對(duì)其研究不夠深入，尚缺乏強(qiáng)有力的理論支撐，所以，其用途目前還是以工業(yè)應(yīng)用居多，作為多羥基化合物的天然單寧的在健康領(lǐng)域的研發(fā)應(yīng)用有待加強(qiáng)。

1.2 花色苷

花色苷又名花青素，廣義的花色苷還包括原花青素，存在于植物根、莖、葉、花等器官細(xì)胞，以糖苷形式存在于液泡中，從而使植物呈現(xiàn)出不同色彩[15]?；ㄉ帐腔ㄇ嗨氐奶擒眨咸丫圃诎l(fā)酵、陳釀和處理過(guò)程中會(huì)形成多種花色苷類衍生物。

花色苷是葡萄酒呈現(xiàn)顏色的物質(zhì)基礎(chǔ)，不僅對(duì)葡萄酒的顏色呈現(xiàn)起重要作用[17-19]，還對(duì)葡萄酒的品質(zhì)具有重要影響，其存在形態(tài)及含量高低會(huì)直接影響葡萄酒的色度、色調(diào)及穩(wěn)定性，還有口感等。在酸性環(huán)境中，B環(huán)上的取代基對(duì)花色苷的顏色具有影響。不同取代基所發(fā)生的顏色變化不同，如增加羥基使其顏色變紅，增加甲氧基使其顏色變成紫色而且穩(wěn)定性增強(qiáng)。由于糖苷化以及?；磻?yīng)，使花色苷的顏色變紅。另外，葡萄酒中的酚類、類黃酮等多酚物質(zhì)也會(huì)和花色苷形成氫鍵，發(fā)揮輔色素作用，使葡萄酒顏色呈現(xiàn)藍(lán)紫色色調(diào)[20]。雖然人們已認(rèn)識(shí)到花色苷對(duì)葡萄酒的顏色呈現(xiàn)和品質(zhì)具有重要影響，并認(rèn)識(shí)到環(huán)境因子如溫度、光照、氧氣和多酚氧化酶等對(duì)酒色酒質(zhì)影響很大，但花色苷的穩(wěn)定性機(jī)制及花色苷與多酚氧化酶的相互作用研究還較少開(kāi)展，葡萄酒中花色苷的生理藥理功能尚未深入研究致使其應(yīng)用范圍受限，鑒于色素類藥物如維生素B2、維生素B12等對(duì)人類健康的重要性，可以相信，花色苷的深入研究定有廣闊的前景。

1.3 白藜蘆醇

白藜蘆醇是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物[21-23]，有順式白藜蘆醇和反式白藜蘆醇兩種結(jié)構(gòu)，紅葡萄酒中主要以反式白藜蘆醇為主，順式異構(gòu)體在葡萄提取物中未檢測(cè)到，可能在發(fā)酵期間被合成。葡萄酒中白藜蘆醇受葡萄品種、生長(zhǎng)環(huán)境和葡萄酒釀造工藝以及葡萄被微生物感染程度等因素影響。白藜蘆醇主要存在于葡萄皮中，所以葡萄酒發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)短以及浸皮效果的好壞是決定其白藜蘆醇含量高低的重要因素。

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，飲用葡萄酒可以有效減少心腦血管疾病的發(fā)生率，后來(lái)發(fā)現(xiàn)這一功效主要?dú)w功于白藜蘆醇，因?yàn)榘邹继J醇可以有效地抑制血小板聚集和低密度脂蛋白形成，調(diào)節(jié)脂蛋白代謝，降低人體血脂，防止血栓形成。白藜蘆醇在人體生理過(guò)程中具有很強(qiáng)的抗氧化和抗自由基能力，能夠抑制多種氧化酶活性[24-26]，在癌細(xì)胞的起始、增殖、發(fā)展3個(gè)主要階段均有抑制乃至逆轉(zhuǎn)作用[27]。此外，白藜蘆醇及其衍生物還具有護(hù)肝、抗炎及激活長(zhǎng)壽基因等作用。雖然人們對(duì)白藜蘆醇的研究報(bào)道較多且已相當(dāng)深入，但對(duì)其藥理功能還需開(kāi)展更為廣泛深入的研究，希望在不遠(yuǎn)的將來(lái)其對(duì)疾病防治的功能能得到國(guó)家官方食品與藥物管理局（food and drug adm inistration，F(xiàn)DA）的認(rèn)可，有幾個(gè)藥品級(jí)的產(chǎn)品投放市場(chǎng)，真正為人類的健康事業(yè)做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。

2 葡萄酒中的多酚氧化酶

2.1 葡萄酒中多酚氧化酶的類型

多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）是動(dòng)植物和微生物中普遍存在的一類含銅離子蛋白酶。早在1883年，日本學(xué)者YOSHID A[28]發(fā)現(xiàn)漆樹(shù)液汁變硬，猜測(cè)這種現(xiàn)象可能是由某種活性物質(zhì)導(dǎo)致；1938年，KEILIN D等[29]利用蘑菇提取純化出一種酶，并將其命名為多酚氧化酶。多酚氧化酶存在廣泛，是引起許多農(nóng)產(chǎn)品及其副產(chǎn)品褐變甚至變質(zhì)的一種酶。

多酚氧化酶在氧參與的情況下能夠把鄰苯二酚氧化成對(duì)應(yīng)的鄰苯醌，鄰苯醌會(huì)進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)形成黑褐色物質(zhì)。這種褐變不僅會(huì)使葡萄酒變色，還會(huì)直接或間接破壞葡萄酒中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使葡萄酒的品質(zhì)發(fā)生變化。王月暉等[30]分析了27種釀酒紅葡萄品種中多酚氧化酶的酶活、總酚以及褐變之間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同釀酒紅葡萄品種中多酚氧化酶的酶活力、總酚含量及褐變度之間存在顯著性差異，多酚氧化酶的活力與多酚含量之間無(wú)顯著相關(guān)性，但與褐變呈正相關(guān)。李青青等[31]測(cè)定了葡萄酒釀造過(guò)程中多酚氧化酶的酶活變化、失活溫度、葡萄酒的pH值、游離SO2、總SO2變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄酒的pH值變化不大、而游離SO2是影響多酚氧化酶活性的主要原因，pH值在一定范圍內(nèi)對(duì)多酚氧化酶活性的影響很小。葡萄酒中主要存在兩種多酚氧化酶，一種是酪氨酸酶，另一種是漆酶[32]。

酪氨酸酶，又被稱為兒茶酚酶，是葡萄果實(shí)中存在的一種正常酶類。研究發(fā)現(xiàn)，剛結(jié)果時(shí)，多酚氧化酶的酶活非常高，被榨成葡萄汁后，一部分酪氨酸酶發(fā)生反應(yīng)，剩余酪氨酸酶依舊在果汁中，但酪氨酸酶活性相比之前提高很多，筆者認(rèn)為，這種現(xiàn)象可能是與氧氣接觸更多的緣故。當(dāng)釀制葡萄酒時(shí)，隨著對(duì)葡萄醪液的不斷處理，酪氨酸酶活性逐漸下降。酪氨酸酶在pH 3～5時(shí)活性最強(qiáng)，pH 7時(shí)最穩(wěn)定；酶活在30℃時(shí)最高，55℃條件下對(duì)其加熱30m in，就可以使酪氨酸酶失活一大部分。所以，酪氨酸酶的存在對(duì)葡萄酒的穩(wěn)定性影響很大。

漆酶并不是葡萄果實(shí)中本身存在的一種酶，是由灰霉菌所分泌的酶類。漆酶存在于一些受到灰霉菌危害的葡萄果實(shí)之中。漆酶能夠輕而易舉的溶于葡萄汁液中，相比酪氨酸酶，漆酶的危害更大，它能對(duì)多種多酚類物質(zhì)產(chǎn)生作用。漆酶在pH 3～5時(shí)酶活最大，最適溫度為40～45℃。但是經(jīng)加熱處理，漆酶就會(huì)很快失去活性。因此，在葡萄酒釀造的任何一個(gè)階段都必須對(duì)漆酶進(jìn)行防治，常用防治方法有通入二氧化硫和加熱等，但筆者認(rèn)為，更主要更主動(dòng)的防治方法是在葡萄種植以及葡萄酒的釀造與儲(chǔ)藏過(guò)程中防治灰霉菌的感染。

2.2 多酚氧化酶的酶活測(cè)定方法

多酚氧化酶活性測(cè)定的方法主要有檢壓法、氧電極法、比色法以及碘量滴定法等。檢壓法是多酚氧化酶酶活特性研究最常用的一種方法，其原理是在有氧條件下，兒茶酚等底物與多酚氧化酶發(fā)生氧化還原反應(yīng)。在一定時(shí)間內(nèi)，酶催化底物發(fā)生氧化還原的反應(yīng)速率與氧氣消耗量呈線性關(guān)系，根據(jù)瓦氏呼吸儀測(cè)定一段時(shí)間內(nèi)氧氣消耗率，進(jìn)而計(jì)算多酚氧化酶酶活。檢壓法雖然測(cè)得的多酚氧化酶酶活比較準(zhǔn)確，但此方法存在操作繁瑣和耗時(shí)長(zhǎng)的缺陷。分光光度法于1974年被人們廣泛采用，其原理是通過(guò)測(cè)量單位時(shí)間內(nèi)兒茶素被多酚氧化酶氧化產(chǎn)生的有色產(chǎn)物的光密度或吸光度值的變化量來(lái)計(jì)算多酚氧化酶的酶活。后來(lái)由于技術(shù)原因，改用鄰苯二酚作為底物替換兒茶素。分光光度法測(cè)定多酚氧化酶活性的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，但受儀器設(shè)備限制，對(duì)吸光度值變化較小或光密度過(guò)高的樣品，分光光度法無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定。除上述兩種方法之外，還有一種靈敏度較高，準(zhǔn)確性較好的氧電極法也常被用來(lái)測(cè)定多酚氧化酶活性。隨著研究的深入，越來(lái)越多的測(cè)定多酚氧化酶酶活的方法被報(bào)道，如極譜電極法、碘量滴定法等[33-34]。

2.3 多酚氧化酶的分離提取與純化

通常根據(jù)多酚氧化酶存在的材料種類來(lái)選擇分離提取方法，材料性質(zhì)的差異決定了多酚氧化酶的分離提取方法的不同，丙酮法和勻漿浸提法是常用的兩種提取多酚氧化酶的方法。丙酮法操作簡(jiǎn)單，且提取出的多酚氧化酶體積較小，便于研究和貯存，但由于丙酮容易使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，所以丙酮法提取的酶活普遍較低。勻漿浸提法除了能除去提取物中雜蛋白之外，還能最大限度地保存多酚氧化酶的酶活[35]。其實(shí)，將勻漿法和丙酮法結(jié)合使用應(yīng)是一種更好的多酚氧化酶的提取方法。

多酚氧化酶粗提出來(lái)后，大都含有許多雜質(zhì)，還需要對(duì)其進(jìn)行分離純化。鹽析和凝膠色譜層析法[36-37]等是早期研究者為達(dá)到純化多酚氧化酶目的所常使用的方法技術(shù)。目前在多酚氧化酶純化技術(shù)中，最常用最廉價(jià)的是硫酸銨鹽析法，因?yàn)榱蛩徜@溶解度大和溫度系數(shù)適合，價(jià)格低廉，且不影響多酚氧化酶活性，分離效果良好。與凝膠層析、離子交換層析等方法相比，分級(jí)沉淀鹽析法具有更優(yōu)良的多酚氧化酶純化效果。

2.4 影響多酚氧化酶酶活的主要因素

2.4.1 pH值

葡萄酒中多酚氧化酶的最適pH值為4.0～7.0，因?yàn)槎喾友趸甘且活惡~離子氧化酶，所以當(dāng)pH小于2時(shí)，多酚氧化酶中銅離子被電離出來(lái)，使多酚氧化酶失活。當(dāng)pH大于10后，多酚氧化酶中銅離子會(huì)結(jié)合氫氧根形成氫氧化銅，同樣使多酚氧化酶發(fā)生失活[38]。ZHENG Y J等[39]對(duì)湯普森無(wú)核葡萄中多酚氧化酶的生化特性及其熱抑制動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶在以鄰苯二酚為底物時(shí)其最適pH值和溫度分別是6.0和25℃。粟銀等[40]發(fā)現(xiàn)馬奶子葡萄中多酚氧化酶的最適pH值為6.0，且在pH 4.5時(shí)會(huì)出現(xiàn)一個(gè)酶活第二高峰，這表明馬奶子葡萄中多酚氧化酶可能存在同工酶，且兩種酶的pH不同。

2.4.2 溫度

多酚氧化酶的本質(zhì)是一種活性蛋白質(zhì)，所以和蛋白質(zhì)一樣，多酚氧化酶對(duì)溫度十分敏感。多酚氧化酶的最適溫度為20～50℃。在70℃下處理很短時(shí)間，多酚氧化酶的酶活急劇下降，這是由于高溫破壞了多酚氧化酶的活性結(jié)構(gòu)，使多酚氧化酶失活。同樣，低溫也可能對(duì)酶活造成影響，使多酚氧化酶出現(xiàn)酶活很小或者沒(méi)有酶活的情況。鄭永菊等[41]對(duì)無(wú)核白葡萄的多酚氧化酶酶學(xué)性質(zhì)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，多酚氧化酶的酶活隨溫度升高而增大，當(dāng)溫度達(dá)到25℃時(shí)，多酚氧化酶的酶活最高，而后開(kāi)始下降，30～60℃對(duì)無(wú)核白葡萄中多酚氧化酶的酶活造成一定破壞，當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)，多酚氧化酶失去酶活。

2.4.3 儲(chǔ)藏條件

多酚氧化酶在氧氣參與情況下，催化單酚、雙酚、多酚等變成醌類，醌類會(huì)進(jìn)一步氧化生成黑褐色色素，即褐變。林向東等[42]在研究時(shí)發(fā)現(xiàn)：蘋(píng)果中的多酚氧化酶酶活隨儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低；üNALMü等[43]在連續(xù)2年間對(duì)2種葡萄中的多酚氧化酶的生化特性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于2個(gè)不同品種的葡萄多酚氧化酶的熱穩(wěn)定性明顯不同。遺憾的是，葡萄酒在長(zhǎng)期儲(chǔ)藏過(guò)程中，多酚氧化酶以及多酚的變化研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

3 展望

人們已對(duì)葡萄酒中的多酚及多酚氧化酶的種類、制備方法、酶活測(cè)定方法、酶活的影響因素等進(jìn)行了一些研究，但研究的廣度和深度都有待擴(kuò)大和提高。雖然目前對(duì)宏量多酚研究較多，但深度欠缺，對(duì)一些含量低的或微量或痕量多酚除了白藜蘆醇外，其他的研究較少。對(duì)于葡萄酒中多酚氧化酶的研究報(bào)告已有一些，但短期研究有報(bào)道，對(duì)于葡萄酒在長(zhǎng)期儲(chǔ)藏過(guò)程中多酚氧化酶的變化規(guī)律及其對(duì)酒質(zhì)的影響尚缺乏研究。尤其是對(duì)葡萄酒中多酚及多酚氧化酶的分子類型、分子組成、分子結(jié)構(gòu)與分子構(gòu)象及其生理藥理功能與相互作用的研究更應(yīng)該深入開(kāi)展，這不僅對(duì)研發(fā)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)葡萄酒具有重要作用，對(duì)于研究開(kāi)發(fā)治療難治性疾病——白癜風(fēng)新藥亦具有重要指導(dǎo)意義。

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Research statusand prospectof polyphenolsand polyphenoloxidases in grape wine

WANGWeiguo,HU Xiaowei
(College ofBioengineering,Henan University ofTechnology,Zhengzhou 450001,China)

Grapewine is rich in nutritionaland health care contentsand hasa setofhealth care function such asanti-cardiovascularand cere-brovascular disease,anti-oxidative,anti-bacterial and anti-cancer,sleeping-enhance,etc.The compounds of polyphenols from grapesw ine were broadly respected as they possess strong antioxidant,anti-bacterial and anti-cardiovascular capacity.But the polyphenol oxidase destroyed the antioxidant capacity of polyphenols,so the nutritionaland health effects ofw ine greatly reduced.The deep research for polyphenolsand polyphenol oxidases in w ine notonly helps the research,developmentand production ofgrapew ine,butalso suppliesw ith references for the research of the science of food, medicine and fruitswine.Thehealth effectsofwineand the variety,origin,preparationmethod,determ iningmethod of enzymatic activity and influencing factors of enzymatic activities in w ine were summarized,aiming to provide a reference for the stable production and quality-improving of w ine.

grapewine;polyphenols;polyphenoloxidase;research status;prospect

TS262.61

0254-5071（2017）08-0016-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.004

2017-06-20

河南省產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目（140207000079）河南省教育廳自然科學(xué)項(xiàng)目（15A550010）

王衛(wèi)國(guó)（1962-），男，教授，碩士，主要從事微生物與生化藥學(xué)研究工作。