黃 鑫，蔣 紅?，王宏軍，李繼昌，陳 磊，馬加峰

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150030；3.遼寧省興城市藥王動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧 興城 125100；4.遼寧省錦州市義縣留龍溝動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧 義縣 121100）

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑在硫酸黏菌素致PC12細(xì)胞凋亡中的作用

黃 鑫1，蔣 紅1?，王宏軍1，李繼昌2，陳 磊3，馬加峰4

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150030；3.遼寧省興城市藥王動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧 興城 125100；4.遼寧省錦州市義縣留龍溝動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧 義縣 121100）

為了探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑在硫酸黏菌素誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡中的作用。取對數(shù)生長期PC12細(xì)胞,用含0、62.5、125、250 μg/mL硫酸黏菌素的DMEM培養(yǎng)液作用24 h，透射電鏡觀察PC12細(xì)胞凋亡，Western blot法檢測GnRP78、caspase-12、Caspase-3蛋白表達(dá)量，F(xiàn)luo-3/AM檢測細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i濃度變化，鈣測定試劑盒檢測細(xì)胞外[Ca2+]i濃度變化。與對照組相比，125、250 μg/mL硫酸黏菌素劑量組PC12細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡現(xiàn)象，使PC12細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i濃度，GnRP78、caspase-12、Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）；細(xì)胞外[Ca2+]i濃度顯著降低（P＜0.01），具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。說明通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑介導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡可引發(fā)硫酸黏菌素的神經(jīng)毒性。

硫酸黏菌素；PC12細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑

“超級細(xì)菌”是對所有抗生素有抗藥性的細(xì)菌的統(tǒng)稱，包括多重耐藥性（MDR）的細(xì)菌和“泛耐藥性”（pan-drug resistance,PDR）細(xì)菌。這些細(xì)菌的耐藥質(zhì)粒能輕易地從一種細(xì)菌跳到另一種上面，對抗幾乎所有的抗生素，一旦“超級細(xì)菌”在全球散播，將面臨抗生素作廢的時(shí)代，危害巨大。目前如美國等歐美國家用于治療多重耐藥革蘭氏陰性細(xì)菌黏菌素感染的有效的抗微生物藥物中就有黏菌素[1-3]。硫酸黏菌素（colistin sulfate）為黏菌素的硫酸鹽，在20世80年代后期，由于黏菌素對腎臟和神經(jīng)有一定的毒性作用，因而限制了黏菌素的應(yīng)用，被其他具有低微的腎毒性和神經(jīng)毒性的抗生素所取代[4-5]。由于研發(fā)新藥時(shí)間長，所以新型抗生素暫未被研發(fā)出來，而黏菌素能切實(shí)有效的殺滅多重耐藥革蘭氏陰性菌，迫使獸醫(yī)研究人員對黏菌素的臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了再次的認(rèn)識(shí)和重新評價(jià)[6-7]。但因神經(jīng)毒性問題仍然存在，所以明確其毒性機(jī)制為尋找新的減毒措施指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。本文選用被廣泛用于神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)毒理學(xué)研究的體外模型大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞（PC12細(xì)胞）[8-9]為研究對象，結(jié)合前期研究成果，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑探討硫酸黏菌素誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的神經(jīng)毒性機(jī)制，為硫酸黏菌素的應(yīng)用提供理論參考，以便于硫酸黏菌素在臨床上更好的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 大鼠腎上腺嗜鉻骨髓瘤細(xì)胞（PC12細(xì)胞），DMEM（Gibco），胎牛血清（四季青），蛋白抽提-RIPA裂解液、GnRP78、caspase-12、Caspase-3多抗、β-actin單抗、Fluo-3/AM、BCA試劑盒，鈣離子試劑盒（凱基生物），硫酸黏菌素、N',N’-亞甲雙丙烯酰胺（Sigma）；丙烯酰胺、甘氨酸（Ameresco），其他試劑均為國產(chǎn)分析純；上述均由博士德生物代購。

1.1.2 儀器 Nikon-1B倒置式生物顯微鏡（日本Nikon公司）；FA2004N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Bio-Rad iMarkTM型酶標(biāo)檢測儀、Fluoroskan Ascent熒光分光光度計(jì)和二氧化碳培養(yǎng)箱（上海一恒公司）；Sigma低溫高速離心機(jī)（美國sigma公司）； GEM-1200ES型透射電子顯微鏡（日本電子公司）；Bio-Rad電泳儀（美國BIO-RAD公司）；WD-9413C凝膠成像系統(tǒng)（北京六一公司）。

1.2 方法

1.2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng)及處理 選擇培養(yǎng)瓶內(nèi)PC12細(xì)胞，以覆滿瓶底80%～90%，處于對數(shù)生長期，細(xì)胞形態(tài)飽滿，光澤好的先懸浮細(xì)胞，離心，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，接種于6孔板，細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，分別添加硫酸黏菌素（無血清的DMEM稀釋藥液），使硫酸黏菌素終濃度為0、62.5、125、250 μg/mL，放入二氧化碳培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，備用[10]。

1.2.2 透射電鏡觀察 染毒與分組處理同1.2.1。收集細(xì)胞，前固定用2.5%戊二醛2 h，后固定用2%的四氧化鋨1.5 h，離心，中間均用冷的PBS緩沖液（pH 7.2）沖洗。用50%、70%、90%酒精依次脫水，100%酒精脫水2次。置換時(shí)先用體積比為1∶1的無水乙醇和100%丙酮，時(shí)間10 min，再用無水丙酮，時(shí)間5 min。包埋時(shí)先以1∶1體積比的無水丙酮與環(huán)氧樹脂812（Epon 812）混合滲透組織，4 000 r/min離心收集細(xì)胞。用吹風(fēng)機(jī)揮發(fā)無水丙酮1 h，Epon 812包埋，經(jīng)聚合、修塊和超薄切片機(jī)切片，染色時(shí)，先用4%醋酸雙氧鈾再用檸檬酸鉛，兩者染色的時(shí)間均為15 min，電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。

1.2.3 Western blot法檢測胞漿內(nèi)GnRP78、caspase-12、Caspase-3蛋白表達(dá) 染毒與分組處理同1.2.1。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞至離心管，冷PBS漂洗，按照博士德生物有限公司的蛋白抽提-RIPA裂解液操作說明加入裂解液，冰上裂解40 min。冷凍離心機(jī)12 000 r/min離心20 min，收集上清，分裝后于-80℃保存。BCA法測定蛋白含量，調(diào)整每份樣品的濃度為30μg/mL，設(shè)3個(gè)重復(fù)，加入加樣緩沖液煮樣后，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，100 v，90 min，用Bio-Rad電泳儀采用三明治夾心法濕轉(zhuǎn)，100 v，2 h，轉(zhuǎn)移結(jié)束，取硝酸纖維素膜，用TBST略洗，封閉液（5%TBST脫脂奶粉液）封閉1 h，TBST洗膜3次；再分別添加抗體，Gn-RP78、caspase-12、Caspase-3這三種為多克隆抗體，β-actin為單克隆抗體，稀釋時(shí)多克隆抗體均用5%TBST脫脂奶粉液1∶200稀釋，單克隆抗體按照1∶400稀釋，4℃孵育過夜，TBST洗3次膜；將對應(yīng)GnRP78、caspase-12、Caspase-3這三種為多克隆抗體的膜放入以封閉液1∶1 000稀釋的山羊抗兔IgG中，對應(yīng)β-actin抗體的膜放入1∶1 000稀釋的山羊抗鼠IgG中，震蕩孵育1 h，TBST洗3次膜。ECL顯影，膠片曝光，定影并晾干，用WD-9413C凝膠分析儀拍照，Image J軟件分析條帶灰度值[7]。

1.2.4 硫酸黏菌素對PC12細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i濃度的影響 染毒與分組處理同1.2.1。經(jīng)過處理的細(xì)胞，棄去上面的培養(yǎng)液，加入無血清培養(yǎng)液，輕晃后再棄去，重復(fù)2次。在暗室中加入用無血清培養(yǎng)液稀釋的5 μmol/L鈣熒光指示劑Fluo-3/AM，錫紙包裹，放入二氧化碳培養(yǎng)箱，孵育50 min，使細(xì)胞負(fù)載Fluo-3。孵育結(jié)束后，在暗室中將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至熒光分光光度計(jì)專用96孔黑板，將雙波長熒光分光光度計(jì)的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別調(diào)整為488 nm和525 nm，使用機(jī)器讀板，所得樣品熒光值記為F，加入0.1% Triton X-100后，測得樣品熒光值記為Fmax，再加入5 mmol/L EGTA，測得樣品熒光值記為Fmin[7]，按下面公式求出[Ca2+]i：

Kd值在37℃為400 nmol/L。每個(gè)樣本測定后均需減去自發(fā)熒光后再進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 硫酸黏菌素對PC12細(xì)胞培養(yǎng)液中[Ca2+]i濃度的影響 染毒與分組處理同1.2.1。收集不同濃度硫酸黏菌素處理后的細(xì)胞上清液，按照鈣試劑盒說明操作，計(jì)算培養(yǎng)液中[Ca2+]i：

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)分析所用的軟件是SPSS 17.0軟件，選擇其中的比較均值中單因素方差分析（AVONA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。各組數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，角標(biāo)*表示數(shù)據(jù)差異顯著（P＜0.05），角標(biāo)**表示數(shù)據(jù)差異極顯著（P＜0.01）。

圖1 電鏡下PC12細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructure of PC12 cells treated with colistin sulfate in electron microscope

2 結(jié)果與分析

2.1 電鏡觀察結(jié)果 透射電鏡下觀察PC12細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖1所示。對照組PC12細(xì)胞膜及細(xì)胞核被膜清晰完整，光滑，細(xì)胞核大，細(xì)胞核里面的染色質(zhì)均勻分布。隨著劑量的增加，細(xì)胞核逐漸變小，并向邊緣靠攏，核里面的染色質(zhì)呈團(tuán)塊狀，逐漸濃縮；基質(zhì)中從62.5 μg/mL硫酸黏菌素劑量組開始出現(xiàn)空泡，到125 μg/mL和250 μg/mL硫酸黏菌素劑量組有片狀空腔演化為空泡化；125 μg/mL和250 μg/mL硫酸黏菌素劑量組線粒體嵴逐漸斷裂、腫脹、溶解、模糊甚至消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間隙變寬，大量核糖體釋放，凋亡小體逐漸增多。

2.2 Western bblloott法檢測胞漿內(nèi)GGnnRRPP7788、ccaass--ppaassee--1122、casppaassee-- 33蛋白表達(dá)結(jié)果 由圖2～5可知，經(jīng)125、250 μg/mL硫酸黏菌素處理24 h后的PC12細(xì)胞，能促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GnRP78、caspase-12、caspase-3表達(dá)水平極顯著增高（P＜0.01），且變化的趨勢較為接近，并存在劑量依賴關(guān)系，由此說明硫酸黏菌素能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡。

2.3 硫酸黏菌素對PPCC1122細(xì)胞內(nèi)[[CCaa22++]]ii濃度影響 硫酸黏菌素對PC12細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i濃度影響如圖6所示。

圖2 GnRP78、caspase-12、caspase-3蛋白表達(dá)的結(jié)果Fig.2 Result of colistin sulfate on the express of GnRP78,caspase-12,caspase-3 in PC 12 cells

圖3 GnRP蛋白表達(dá)水平Fig.3 The express level of GnRP78 in PC 12 cells

圖4 caspase-12蛋白表達(dá)水平Fig.4 The express level of caspase-12 in PC 12 cells

圖5 caspase-3蛋白表達(dá)水平Fig.5 The express level of caspase-3 in PC 12 cells

圖6 硫酸黏菌素對PC12細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i濃度的影響Fig.6 Effect of colistin on intracellular free Ca2+concentration in PC12

由圖6能明確看出，以對照組為參比，隨著硫酸黏菌素濃度增加，可使PC12細(xì)胞內(nèi)的[Ca2+]i濃度極顯著升高。

2.4 硫酸黏菌素對PPCC1122細(xì)胞外[[CCaa22++]]ii濃度影響 硫酸黏菌素對PC12細(xì)胞外[Ca2+]i濃度影響如圖7所示。與對照組相比，經(jīng)硫酸黏菌素處理24h后，隨著硫酸黏菌素濃度增加，可使PC12細(xì)胞外的[Ca2+]i濃度極顯著降低。

3 討論

神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子不僅能調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的損傷、修復(fù)和神經(jīng)元的興奮性，還能在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起至關(guān)重要的作用[7，11]。在靜息狀態(tài)下，神經(jīng)細(xì)胞外鈣離子濃度等同于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的鈣離子濃度，比細(xì)胞胞漿內(nèi)鈣離子濃度高10 000倍；為了維持細(xì)胞內(nèi)外鈣離子環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)，需要借助細(xì)胞質(zhì)膜上鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)（包括受體門控通道和電壓依賴性鈣通道）及細(xì)胞內(nèi)鈣池的調(diào)控，這兩方面的協(xié)同作用使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子泵出細(xì)胞外，以保持鈣穩(wěn)態(tài)。當(dāng)面臨外來刺激或機(jī)體病態(tài)時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)大量鈣離子從胞外流入胞內(nèi)，鈣穩(wěn)態(tài)被破壞，失去原有的平衡，導(dǎo)致鈣超載，引發(fā)神經(jīng)毒性。細(xì)胞內(nèi)高濃度的鈣離子可激活多種酶和鈣依賴蛋白，這些酶和蛋白的激活，可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上caspase-12被釋放并激活，從而激活caspase-3，導(dǎo)致caspase依賴性凋亡的發(fā)生，因而細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，被認(rèn)為是凋亡的始動(dòng)因素[7]，目前已經(jīng)通過試驗(yàn)證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加是凋亡的誘發(fā)因素之一，Ca2+在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起重要作用[12-14]。本試驗(yàn)可知，250 μg/mL和125 μg/mL硫酸黏菌素處理組的PC12細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i濃度極顯著增加，PC12細(xì)胞外[Ca2+]i濃度極顯著降低，說明硫酸黏菌素能改變細(xì)胞內(nèi)外鈣離子平衡關(guān)系，使細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡。

圖7 硫酸黏菌素對PC12細(xì)胞外[Ca2+]i含量影響Fig.7 Effect of colistin on extracellular free Ca2+concentration in PC12

在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，有HSP70家族分子伴侶即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GnRP78（Bip），在靜息狀態(tài)下，GnRP78與跨膜蛋白ATF6、Irel和PERK在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中以結(jié)合狀態(tài)存在，在電鏡觀察結(jié)果中可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間隙變寬，說明硫酸黏菌素的刺激可以使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，導(dǎo)致胞漿內(nèi)[Ca2+]i濃度升高，由此引發(fā)非折疊蛋白反應(yīng)（UPR），導(dǎo)致GnRP78蛋白的含量升高，余留的GnRP78蛋白與折疊錯(cuò)誤蛋白結(jié)合，使ATF6、Irel和PERK這三個(gè)蛋白解離。于是這三個(gè)蛋白將各自或協(xié)同啟動(dòng)凋亡信號(hào)途徑[7，15]。硫酸黏菌素使鈣穩(wěn)態(tài)失衡是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入非折疊蛋白反應(yīng)的誘因，可導(dǎo)致PC12細(xì)胞內(nèi)GnRP78增多。GnRP78變多，促使Bip/ GnRP78-procaspase-12-caspase-7解體，分成三個(gè)獨(dú)立部分，其中caspase-7釋放增加，可對caspas-12前體作用，使其促進(jìn)caspas-12的活化，從而誘發(fā)下游的caspase-9活化，caspase-9又可以激活caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[16-17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明硫酸黏菌素可使細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致GnRP78的表達(dá)極顯著升高，使caspase-12蛋白表達(dá)水平增加，最終使caspase-3被激活而使細(xì)胞凋亡發(fā)生，說明硫酸黏菌素通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

硫酸黏菌素通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，是其神經(jīng)毒性的機(jī)制之一，該研究為預(yù)防和控制硫酸黏菌素的神經(jīng)毒性提供了基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)。

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The effect of endoplasmic reticulum pathway of apoptosis induced by colistin sulfate in PC12 cells

Huang Xin1,Jiang Hong1*,Wang Hongjun1,Li Jichang2,Chen Lei3,Ma Jiafeng4
(1.Jinzhou Medical University,Liaoning Jinzhou 121001; 2.Northeast Agricultural University,Heilongjiang Harbin 150030; 3.Xingcheng city Yaowang animal health supervision,Liaoning Xingcheng 125100; 4.Yixian Liulonggou animal health supervision,Liaoning Yixian 121100)

In order to explore the effect of endoplasmic reticulum pathway of colistin sulfate induced apoptosis in PC12 cells.PC12 cells were treated with colistin sulfate dissolved in the DMEM for 24 h,whose final concentrations were 0,62.5,125 and 250μg/mL respectively.The apoptosis was detected by transmission electron microscopy.Expression of GnRP78,caspase-12,Caspase-3 protein was detected by western blotting.Intracellular and extracellular free Ca2+concentration in PC12 cells was detected by Fluo-3/AM and Kit.Compared with control group,125 μg/mL, 250μg/mL colistin sulfate could appear typical characteristics of apoptosis in PC12 cells,significantly increase(P＜0.01).Intracellular free Ca2+concentration and the expression of GnRP78, caspase-12,Caspase-3 protein,extracellular free Ca2+concentration significantly reduce(P＜0.01). The results showed that the apoptosis induced by endoplasmic reticulum pathway was neurotoxicity mechanisms caused by colistin sulfate.

Colistin sulfate;PC12 cell;Cell apoptosis;Eendoplasmic reticulum pathway

S859.8

B

1672-9692(2016)12-0001-07

2016-11-02

黃鑫（1994-），女，本科在讀，動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)。

蔣紅（1977-），女，博士，副教授，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)和毒理學(xué)研究。

遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：201410160049）；遼寧省科學(xué)技術(shù)基金自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2014022051）。