張巖彬

（遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 沈陽 110003）

Zhang Yanbin

(The Liaoning Institute of safety supervision for animal products,Liaoning Shenyang 110003)

CDV、CAV疫苗三免后鴨蛋卵黃抗體制備及效價消長規(guī)律探究

張巖彬

（遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 沈陽 110003）

利用犬瘟熱商品疫苗和狐貍腦炎商品疫苗分別免疫開產(chǎn)蛋鴨，三免后收集高免鴨蛋，用水稀釋法和硫酸銨兩步沉淀法提純卵黃抗體。采用SDS-PAGE檢測鴨源IgY濃度，中和試驗和HA-HI試驗測定相應(yīng)效價。結(jié)果表明，水溶法制備的卵黃抗體濃度為6.33 mg/mL，得率為60%～70%。免疫CDV疫苗組和CAV疫苗組可以很快產(chǎn)生特異性抗體。在30～60 d內(nèi)，卵黃抗體效價極高；在60～120 d內(nèi)，卵黃抗體效價維持較高水平；在120～180 d內(nèi)，效價趨近于零。

犬瘟熱病毒；狐貍腦炎病毒；卵黃抗體；消長規(guī)律

Zhang Yanbin

(The Liaoning Institute of safety supervision for animal products,Liaoning Shenyang 110003)

犬瘟熱和狐貍腦炎是危害毛皮動物養(yǎng)殖的兩種主要急性、高度接觸性傳染病，其病原體分別為犬瘟熱病毒（canine distempervirus，CDV）和犬腺病毒（canine adenovirus，CAV）。狐貍、貉、水貂等毛皮動物普遍易感，幼獸致死率極高。目前，這兩種疫病在毛皮動物各主要養(yǎng)殖地域均有群發(fā)性流行記錄[1-2]。

通過接種疫苗能夠較有效地預(yù)防這兩種疫病，但CDV和CAV的弱毒商品化疫苗存有熱穩(wěn)定性差、易受母源抗體干擾、毒力返祖返強(qiáng)、一過性免疫抑制等弊端。所以，近年來人們開始尋求新的免疫替代性方案。卵黃抗體（Immunoglobulin of yolk，IgY）作為一種廉價高效、制備簡單的生物制品備受人們關(guān)注。卵黃抗體是一類在禽類動物體內(nèi)廣泛存在的特異性免疫球蛋白，通常伴隨血液循環(huán)在卵巢中富集蓄積并最終進(jìn)入卵黃。在臨床上目前大規(guī)模生產(chǎn)卵黃抗體多采用水溶法（water dilution，W.D.）[3-4]。

在本研究中，通過CDV、CAV商品化疫苗免疫康貝爾蛋鴨，并對其開產(chǎn)6個月內(nèi)產(chǎn)蛋進(jìn)行了IgY提純和效價檢測，繪制出了IgY效價消長規(guī)律曲線。

1 材料和方法

1.1 試驗材料 免疫抗原：采用北京生態(tài)康生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的CDV（生產(chǎn)批號：1412077）、CAV（生產(chǎn)批號：141123）商品疫苗。

試驗動物：空白免疫背景的120日齡康貝爾蛋鴨30只。

主要試劑儀器：DYCZ-28D型電泳儀（北京六一儀器廠）、ZF-258型凝膠成像儀（上海方畦儀器有限公司）、1%人O型紅細(xì)胞、血凝板、Hyclone胎牛血清（500 mL）、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、光學(xué)倒置顯微鏡等。

1.2 試驗方法 前期準(zhǔn)備：將30只110日齡空白免疫背景的康貝爾蛋鴨在封閉環(huán)境中飼養(yǎng)至開產(chǎn)，每組10只，采用胸肌、翅下肌肉注射方式，分別對應(yīng)接種CDV、CAV和生理鹽水。1 mL/次，共計3次，間隔期1周。在三免后1周、2周、3周、4周、8周、12周、16周、20周和24周采集相應(yīng)鴨蛋樣本。

鴨源卵黃抗體制備提純：將高免鴨蛋消毒、清洗、吹干，無菌室里手動剝離卵黃，去除蛋清，劃破卵黃膜，用量筒準(zhǔn)確測定體積。加入9倍去離子水，攪拌混勻6 h，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.3～5.4，4℃靜置過夜，中速離心后分離獲取上清。在上清中加入硫酸銨依次至50%和33%飽和度，中速離心后收集析出沉淀。用無菌PBS重懸溶解后至透析袋中除鹽，萘氏試劑檢測合格后，將濾液用0.22 μm濾膜過濾除菌，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

鴨源IgY組成、含量、濃度及效價測定：分別用SDS-PAGE檢測提取物IgY成分，ZF-258型凝膠成像儀分析蛋白含量，BCA蛋白濃度試劑盒測定IgY濃度。用細(xì)胞中和試驗測定CDV組IgY抗體效價，用HA-HI試驗測定CAV組IgY抗體效價。

卵黃抗體效價測定

血清中和試驗：采用Reed-Muench法[1]測得CDV疫苗弱毒半數(shù)組織感染量（TCID50）為106/mL，采用固定病毒-稀釋血清法做細(xì)胞中和試驗。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞24 h至細(xì)胞長滿80%時，將IgY做100倍稀釋，等量吸取200TCID50CDV弱毒與IgY 37℃感作2 h，接種BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)觀察感染效應(yīng)。

HA/HI試驗：CAV能與人O型紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)[1]，測出該CAV病毒血凝效價為1∶256。依據(jù)血凝效價配制4血凝單位的CAV病毒液，采用固定病毒稀釋血清的方法，將IgY在血凝板上依次2倍倍比稀釋，測定血凝抑制（HI）效價。

鴨源IgY無菌檢驗：將提取除菌后的IgY分別接種于葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、酪陳培養(yǎng)基中，25℃和37℃下培養(yǎng)72 h，觀察是否有細(xì)菌生長。

圖1 12%SDS-PAGE檢測提取鴨源IgYFig.1 12%SDS-PAGE detection of duck source IgY extraction

2 結(jié)果

2.1 SDS--PPAAGGEE檢測提取純化的鴨源IIggYY 見圖1。

12%SDS-PAGE結(jié)果表明，提取鴨源卵黃抗體主要分布于67 kD和38 kD，圖像經(jīng)Quality One凝膠成像分析軟件分析，IgY目的蛋白占泳道總蛋白的60%～70%。經(jīng)BCA蛋白濃度檢測試劑盒測得卵黃蛋白濃度為6.33 mg/mL。

圖2 CDV中和試驗BHK細(xì)胞出現(xiàn)的“合胞體”Fig.2 Syncytium in BHK Cells for CDV Neutralization test

圖3 CAV組鴨源IgY HI效價測定Fig.3 CAV group of duck origin HI IgY titer determination

2.2 效價的測定 見圖2和圖3。

CAV的血凝效價為1∶256，為1個血凝單位。將CAV病毒液稀釋至4個血凝單位，即1∶64。血凝抑制試驗結(jié)果表明，提取的IgY能夠有效中和CAV，血凝抑制效價在1∶256～1∶512之間。

2.3 效價變化規(guī)律 見圖4和圖5。

圖4 CDV組IgY抗體中和效價Fig.4 IgY antibody neutralization titer ofCDV group

圖5 CAV組IgY抗體血凝抑制效價Fig.5 CAV group IgY antibody titers of blood coagulation

透析后IgY溶液做100倍稀釋后進(jìn)行效價測定，上述兩組效價測定結(jié)果表明，IgY效價消長趨勢基本一致。在接種CDV 200TCID50條件下，中和效價峰值達(dá)到了1∶104；CAV組HA效價為1∶256，其IgY HI效價峰值達(dá)到了1∶350。

在持續(xù)時間上，兩組均表現(xiàn)為16～20周內(nèi)有較好的抗體水平。20周后抗體效價下降迅速，至24周時與陰性組差別不大。

成功運(yùn)用水溶法提取了較高濃度鴨源的卵黃抗體，得率在60%～80%，同時繪制了三免后IgY濃度和效價的消長曲線。三免后抗體效價迅速上升，到峰值后下降，在20周內(nèi)二者消長規(guī)律基本一致。至20～24周時，抗體效價與陰性組相差不大。

以上結(jié)果為臨床上大規(guī)模提取純化IgY奠定了理論基礎(chǔ)，也為毛皮動物常見疾病（CDV、CAV）的預(yù)防和治療提供了新的途徑。

2.4 鴨源IIggYY無菌檢驗結(jié)果 25℃和37℃下培養(yǎng)72 h，在葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基未發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長，表明IgY濾過液中無腐生菌、霉菌存在。在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、酪陳培養(yǎng)基中均未有細(xì)菌生長，表明IgY濾過液中無厭氧性和需氧性細(xì)菌的存在。

3 討論與展望

3.1 禽蛋的選擇 提取卵黃抗體以雞蛋較為常見，對于鴨（鵝）蛋研究較少。目前，對于鴨、鵝等水禽聚居區(qū)，選用鴨（鵝）蛋作為IgY提取對象較為適宜。在本試驗中，嘗試并證明了鴨源卵黃抗體提取的可行性，繪制了三免后抗體消長規(guī)律等，為臨床上大規(guī)模生產(chǎn)鴨源卵黃抗體提供了借鑒。

3.2 鴨源IIggYY的提純 水溶法提取鴨源卵黃抗體，稀釋倍數(shù)不宜過高或過低。經(jīng)多次試驗，在1∶10稀釋時提取效率最高。溶液體積不會過大，卵黃也幾乎沒有沉淀；對于卵黃液中含有的大量蛋白質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)，在提純時必須盡可能多的除去。此時，加入少量氯仿或者正辛酸攪拌可有助于除脂；在4℃條件下靜置3 h以上，有利于沉淀、脂質(zhì)和上清的分層；硫酸銨兩步沉淀法多采用50%和33%飽和度，在透析袋選擇上要選截留量30 kD以上，以減少蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)留存和確保銨根離子完全除去；在濾膜過濾除菌時，可先選用0.45 μm濾膜再用0.22 μm濾膜過濾，以減少濾膜堵塞和浪費(fèi)[5]。

3.3 鴨源IIggYY的濃度及效價檢測 經(jīng)過12% SDS-PAGE分析后，條帶集中于67 kD和38 kD間，與先前文獻(xiàn)報道相一致。經(jīng)Quality One凝膠定量分析軟件分析，IgY純度最高為68.4%，BCA蛋白濃度檢測試劑盒測得卵黃蛋白濃度為6.33 mg/mL。

效價測定上，CDV采用了更為精確、直接的細(xì)胞中和試驗。CAV能特異性地與人O型紅細(xì)胞發(fā)生凝集，采用了操作簡單便捷的HA-HI試驗。經(jīng)檢測，這兩組效價峰值極高，在三免120～150 d內(nèi)具有高保護(hù)作用。在150～180 d內(nèi)，抗體保護(hù)趨于作用。這對于免疫節(jié)點(diǎn)的選擇至關(guān)重要。

以上結(jié)果為臨床上大規(guī)模提取純化IgY奠定了理論基礎(chǔ)，也為毛皮動物常見疾病的預(yù)防和治療提供了新的途徑[6-7]。作為毛皮動物的兩種主要疫病，疫苗接種防治CDV和CAV的主要方式。但疫苗接種存有毒力返祖返強(qiáng)、一過性免疫抑制等諸多不安全因素。卵黃抗體技術(shù)相應(yīng)地解決了這一問題并且已經(jīng)發(fā)展相對成熟[7]，未來隨著生物制品種類和市場的日益豐富，卵黃抗體產(chǎn)品也必將有著廣闊的市場和光明的未來。

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The study of IgY variation rules after immunization with CDV,CAV inactivated vaccine

The commercial Fox Encephalitis Vaccine and canine distemper vaccine were immunized with new laying ducks.After immuned 3 times,we collected the eggs to extract IgY with Water dilution method and ammonium sulfate two step precipitation method.SDS-PAGE was used to detect the IgY concentration of the eggs,and the corresponding titer was determined by neutralization test and HA-HI test.The results showed that the concentration of IgY prepared by the water solution method was 6.33 mg/mL,and the yield was 60%～70%.Immunization of the CDV vaccine group and the CAV vaccine group can produce specific antibodies very soon.Within 30-60 days,the IgY titer was very high.In 60～120 days,the yolk antibody titer remained high.Within 120～180 days,the titer was close to 0.

Canine distempervirus;Canine adenovirus;Immunoglobulin of yolk;Variation rules

S858.2

B

1672-9692(2016)12-0039-05

2016-11-06

張巖彬（1966-），男，本科，畜牧師，主要研究方向：動物飼養(yǎng)及疾病防控，畜產(chǎn)品安全監(jiān)督。