王松明，顧招兵，朱雅新，冷靜，馮勵(lì)，李清，楊舒黎*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201；2.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京朝陽(yáng)100101）

蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)概述

王松明1，顧招兵1，朱雅新2，冷靜1，馮勵(lì)1，李清1，楊舒黎1*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201；2.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京朝陽(yáng)100101）

定向進(jìn)化技術(shù)是近二十年發(fā)展起來(lái)的蛋白質(zhì)改造技術(shù)，其可通過(guò)對(duì)基因的突變和重組來(lái)構(gòu)建突變庫(kù)，然后通過(guò)高通量的篩選鑒定性能改善的突變體，此技術(shù)是改善酶性能最有效的途徑之一。本文就定向進(jìn)化技術(shù)的幾種常用方法和定向進(jìn)化后的文庫(kù)篩選、應(yīng)用及展望進(jìn)行了概述。

定向進(jìn)化；易錯(cuò)PCR；DNA改組；定向篩選

1967年Spiegelman等提出在分子水平上體外定向進(jìn)化生物分子的思想，當(dāng)時(shí)他們定向進(jìn)化的對(duì)象是RNA（Spiegelman等，1969、1967）。定向進(jìn)化屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì)范疇，其不需要事先了解蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)效關(guān)系，而是在體外模擬自然進(jìn)化的過(guò)程（隨機(jī)突變、重組和選擇），使基因發(fā)生大量變異，從而在較短時(shí)間內(nèi)定向選擇出所需性質(zhì)或功能的基因。定向進(jìn)化的實(shí)質(zhì)是達(dá)爾文進(jìn)化論在分子水平的應(yīng)用和延伸。

1 定向進(jìn)化方法

目前常用的定向進(jìn)化技術(shù)有易錯(cuò)PCR（Chen等，1991）、DNA改組（Stemmer等，1994）、交錯(cuò)延伸（Zhao等，1998；Stemmer等，1994）、體外隨機(jī)引發(fā)重組（Shao等，1998）、漸增切割法產(chǎn)生雜和酶（Ostermeier等，1999）、酵母增強(qiáng)組合文庫(kù)（Abecassis等，2000）、過(guò)渡模板隨機(jī)嵌合生長(zhǎng)技術(shù)（Coco等，2001）、不依賴序列同源性的蛋白質(zhì)重組（Sieber等，2001）等。定向進(jìn)化技術(shù)已被用于許多酶性能的改善。

1.1 易錯(cuò)PCR易錯(cuò)PCR（ep-PCR）原理是在體外擴(kuò)增基因時(shí)使用適當(dāng)?shù)臈l件，使擴(kuò)增的基因出現(xiàn)少量堿基誤配而引起突變。如增加Mg2+濃度，使用低保真度的Taq酶，改變反應(yīng)體系中4種dN TP的濃度，加入Mn2+，采用突變酶等。也可以改變多個(gè)條件，增大堿基誤配的機(jī)率。易錯(cuò)PCR只能使原始蛋白質(zhì)中很小的序列空間發(fā)生突變，因而一般適用于較小的基因片段（<2000 bp）。但對(duì)于初涉定向進(jìn)化的研究者，易錯(cuò)PCR不失為一種有效、實(shí)用的進(jìn)化方法。另外，迭代易錯(cuò)PCR可使小的有益突變累積而產(chǎn)生大的提高（You等，1996；Reuben等，1969）。Chen等（1993）用易錯(cuò)PCR定向進(jìn)化枯草桿菌蛋白酶，所得的突變體在60%和85%的二甲基甲酞胺中，催化效率Kca/Km分別是野生酶的256和131倍，比活性提高了157倍。

1.2 DNA改組DNA改組（DNA shuffling）是用重組的方法將兩種以上同源正突變基因序列（或天然存在的基因家族）重新排布而引起基因突變的進(jìn)化技術(shù)，由Stemmer等（1994）首次提出并成功運(yùn)用。該法是對(duì)某一目的序列進(jìn)行DNaseⅠ隨機(jī)片段化，然后對(duì)這些短片段進(jìn)行組裝和基因重組，最后對(duì)這些組裝和基因重組的片段進(jìn)行篩選，篩選有意義和達(dá)到目的的正向重組子，對(duì)于一輪重組的結(jié)果不好時(shí)可以重復(fù)多次進(jìn)行DNA改組。當(dāng)DNA改組用來(lái)重組一套進(jìn)化上相關(guān)的基因時(shí)，又被稱為家族改組，如改組4種頭孢菌素酶基因，酶活增加了270～540倍，而單基因改組只增加了8倍（Crameri等，1994）。對(duì)于易錯(cuò)PCR，DNA改組技術(shù)可以說(shuō)是一次成功的飛躍，能將兩個(gè)或多個(gè)父本基因的優(yōu)良性狀加以組合，從而構(gòu)建出更多樣性的突變文庫(kù)，在實(shí)際應(yīng)用中常與易錯(cuò)PCR技術(shù)結(jié)合使用。

1.3 交錯(cuò)延伸重組基于DNA改組的原理提出了交錯(cuò)延伸（StEP）重組技術(shù)，其是一種簡(jiǎn)化的DNA改組技術(shù)。與DNA改組不同的是，其將含不同點(diǎn)突變的模板混合進(jìn)行PCR反應(yīng)，同時(shí)將常規(guī)的退火和延伸合并為一步，并大大縮短其反應(yīng)時(shí)間，從而只能合成出非常短的新生鏈，隨之進(jìn)行多輪變性、短暫復(fù)性/延伸反應(yīng)，此過(guò)程反復(fù)進(jìn)行直至獲得全長(zhǎng)基因。重組的程度可以通過(guò)調(diào)整反應(yīng)時(shí)間和溫度來(lái)控制。在每一輪PCR循環(huán)中，部分延伸的片段可以隨機(jī)雜交到含有不同突變的模板上繼續(xù)延伸，由于模板轉(zhuǎn)換而實(shí)現(xiàn)不同模板間的重組。Zhao等（1998）利用迭代易錯(cuò)PCR獲得隨機(jī)點(diǎn)突變，并用交錯(cuò)延伸方法重組DNA，采用連續(xù)提高培養(yǎng)溫度對(duì)突變體進(jìn)行篩選最終獲得一株突變體，在酶的功能未發(fā)生任何變化的前提下，不僅將該酶的最適溫度提高了17℃，還使酶在65℃的半衰期延長(zhǎng)了200倍。

1.4 體外隨機(jī)引發(fā)重組基于DNA改組的原理，提出了體外隨機(jī)引發(fā)重組（RPR）技術(shù)。其是用一套隨機(jī)序列引物，產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的短DNA片段庫(kù)（由于堿基的錯(cuò)配，這些短DNA片段也含有少量的點(diǎn)突變）。然后進(jìn)行類似于DNA改組的全長(zhǎng)基因裝配反應(yīng)，獲得多樣性文庫(kù)。與DNA改組相比，RPR具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）可用單鏈DNA或mRNA為模板。（2）模板量要求少，大大降低了親本組分，篩選便利。（3）隨機(jī)片段不是由親本基因切割獲得，大大降低了親本DNA的制備量。（4）克服了DNA改組中DNaseⅠ所具有的序列偏愛性，保證了子代全長(zhǎng)基因中突變和交叉的隨機(jī)性。（5）片段組裝體系與片段合成體系緩沖系統(tǒng)可兼容，組裝前無(wú)需純化操作。（6）合成的隨機(jī)引物具有同樣長(zhǎng)度，無(wú)序列傾向性。在理論上，PCR擴(kuò)增時(shí)模板上每個(gè)堿基都應(yīng)被復(fù)制或以相似的頻率發(fā)生突變。（7）隨機(jī)引發(fā)合成的DNA不受模板DNA長(zhǎng)度的限制。Shao等（1998）利用RPR方法成功地對(duì)枯草桿菌蛋白酶E進(jìn)行了定向進(jìn)化，經(jīng)體外隨機(jī)引發(fā)重組得到突變酶，其熱穩(wěn)定性比原始酶提高8倍。

1.5 漸增切割法產(chǎn)生雜和酶為了解決DNA改組介導(dǎo)的重組通常不能用于重組同源性低于70%～80%序列的問(wèn)題（徐卉芳等，2002）。而自然界大多數(shù)同源序列具有比這個(gè)數(shù)目低得多的相似性。Benkovic研究組建立了漸增切割法產(chǎn)生雜和酶（ITCHY）及Thio-ITCHY（α-硫代磷酸核苷酸介導(dǎo)的ITCHY）方法來(lái)產(chǎn)生不依賴于DNA序列同源性的重組文庫(kù)。ITCHY的基本原理是控制核酸外切酶Ⅲ的切割速度，間隔很短時(shí)間連續(xù)取樣終止反應(yīng)，從而獲得一組依次有一個(gè)堿基缺失的片段庫(kù)；然后將兩組隨機(jī)長(zhǎng)度的5′端片段與3′端片段隨機(jī)融合產(chǎn)生雜合基因文庫(kù)。Lutz等（2001）在此基礎(chǔ)上又提出了Thio-ITCHY方法，首先在同一載體上將待重組的兩基因串聯(lián)，然后在產(chǎn)物中通過(guò)PCR反應(yīng)或單鏈模板引伸反應(yīng)隨機(jī)引入α-硫代磷酸核苷酸，由于其抗核酸外切酶Ⅲ的切割，切割反應(yīng)會(huì)在隨機(jī)終止，連接切割產(chǎn)物即產(chǎn)生隨機(jī)交叉文庫(kù)。ITCHY/Thio-ITCHY不依賴DNA序列同源性，可在非序列同一區(qū)內(nèi)產(chǎn)生活性融合子。迭代ITCHY或?qū)ζ湮膸?kù)進(jìn)行重組還可以創(chuàng)造多個(gè)交叉。

1.6 酵母增強(qiáng)組合文庫(kù)酵母增強(qiáng)組合文庫(kù)（CLERY）是一個(gè)真核基因家族改組策略。其原理是將體外DNA改組程序與酵母體內(nèi)重組締合起來(lái)，構(gòu)建高豐度低親本水平的重組文庫(kù)。直接用含目的基因的質(zhì)粒作為體外改組的模板；改組后基因產(chǎn)物與線性化的酵母表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞啟動(dòng)體內(nèi)重組事件，同時(shí)表達(dá)功能性重組子直接用于篩選。Truan等（2000）用該法重組人細(xì)胞色素P450 1A1和1A2，所得文庫(kù)含86%的嵌合基因，大大提高了文庫(kù)豐度。

1.7 過(guò)渡模板隨機(jī)嵌合生長(zhǎng)技術(shù)過(guò)渡模板隨機(jī)嵌合生長(zhǎng)（RACHITT）技術(shù)（Coco等，2001）是與DNA改組概念上明顯不同的、改進(jìn)的基因家族重組技術(shù)。其是將隨機(jī)切割的基因片段雜交到一個(gè)臨時(shí)DNA模板上，進(jìn)行排序、修剪、空隙填補(bǔ)和連接的過(guò)程。過(guò)渡摸板是一條以一定間隔插入尿嘧啶的單鏈DNA分子，其中的懸垂切割步驟使短片段（比DNaseⅠ消化片段還短）得以重組，明顯提高了重組頻率和密度（劉衛(wèi)曉等，2004）。Coco等（2001）利用RACHITT技術(shù)對(duì)二苯并噻吩單加氧酶進(jìn)行改造，產(chǎn)生的嵌合文庫(kù)平均每個(gè)基因含14個(gè)交叉，重組水平比DNA改組類方法（1～4個(gè)交叉）高出幾倍，并且可在短至5 bp的序列同一區(qū)內(nèi)產(chǎn)生交叉，經(jīng)篩選得到的突變酶不僅活力有所提高，酶的作用底物范圍也得到明顯拓寬。

1.8 不依賴序列同源性的蛋白質(zhì)重組Sieber等（2001）提出了不依賴序列同源性的蛋白質(zhì)重組（SHIPREC）方法，其可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收單基因長(zhǎng)度隨機(jī)片段，保證了子代嵌合體長(zhǎng)度的保守性，使交叉保持了適當(dāng)?shù)男蛄衅ヅ?，主要發(fā)生在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的位點(diǎn)，交叉點(diǎn)處的兩個(gè)氨基酸仍處于其在親本蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的位置，從而提高了文庫(kù)中陽(yáng)性克隆的比例。迭代SHIPREC可以產(chǎn)生多個(gè)交叉。

綜上所述，利用定向進(jìn)化創(chuàng)建序列多樣性文庫(kù)的各種方法。都有其優(yōu)缺點(diǎn)，但任何一種方法都不是萬(wàn)能的，在實(shí)際應(yīng)用中，我們應(yīng)該針對(duì)具體問(wèn)題，選擇合適的方法或方法組合，從而達(dá)到事半功倍的效果。

2 定向進(jìn)化文庫(kù)的篩選方法

酶或者蛋白質(zhì)在進(jìn)行定向進(jìn)化后會(huì)產(chǎn)生定向進(jìn)化文庫(kù)，定向進(jìn)化的關(guān)鍵在于進(jìn)化后可從文庫(kù)中篩選出想要的突變個(gè)體。在一個(gè)突變體庫(kù)建好之后，選擇一個(gè)靈敏、高通量、能用于目標(biāo)篩選的方法，能否快速、準(zhǔn)確的在龐大的突變體庫(kù)中尋找出所需克隆是決定定向進(jìn)化成敗的關(guān)鍵。

定向進(jìn)化技術(shù)表達(dá)體系的選擇決定了篩選/選擇的方式，定向進(jìn)化技術(shù)表達(dá)體系的宿主基本分為兩類：原核生物大腸桿菌（E.coli）和真核生物酵母（張達(dá)，2011）。E.coli易于生長(zhǎng)和控制，操作方便、快捷、周期短。由于E.coli表達(dá)外源蛋白時(shí)容易形成包涵體，因此外源基因尤其是真核生物基因在E.coli中表達(dá)時(shí)，常常需要經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎才能獲得可溶蛋白。利用酵母作為宿主細(xì)胞時(shí)，通常選擇的載體是能夠在宿主內(nèi)自主復(fù)制的釀酒酵母細(xì)胞。近年來(lái)，畢赤酵母作為宿主應(yīng)用于酶的定向進(jìn)化取得成功，利用畢赤酵母作為宿主的關(guān)鍵是構(gòu)建能夠在其體內(nèi)表達(dá)的自主復(fù)制質(zhì)粒載體。另外，除了大腸桿菌和酵母外，噬菌體表面展示技術(shù)（李麗芳等，2005；巨立中等，2003；Pedersen等，1998）、核糖體展示技術(shù)（Matsuura等，2003；Lamla等，2003）、熒光激活細(xì)胞分選（FACS）技術(shù)（Cohen等，2001）等也應(yīng)用于定向進(jìn)化中。

2.1 平板篩選平板篩選主要是依據(jù)細(xì)胞的表型，將含有隨機(jī)突變基因的重組細(xì)胞從平板培養(yǎng)基上篩選出來(lái)。根據(jù)細(xì)胞表型的多樣性，可以從多個(gè)方面篩選突變基因，例如逐步改變重組細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境，依據(jù)細(xì)胞的耐受情況，可以篩選出一些對(duì)熱、pH、抗生素等耐受性提高的突變酶；也可以將突變酶作用的底物加入平板培養(yǎng)基中，依據(jù)最終形成的透明圈的大小來(lái)篩選活力提高的酶，或者利用營(yíng)養(yǎng)缺陷株作為宿主菌，根據(jù)菌株的生長(zhǎng)情況對(duì)突變酶進(jìn)行篩選；此外，通過(guò)顏色的變化排除無(wú)效重組細(xì)胞，也可以篩選高活力的突變酶（李珍華等，2013）。pH指示劑法常用于檢測(cè)酯酶，以酚紅為指示劑，隨著酶催化酯類水解產(chǎn)生酸，通過(guò)體系中pH改變導(dǎo)致的顏色變化，就可以初步測(cè)定酶的活性（周瓊等，2012）。

2.2 表面展示表面展示技術(shù)主要包括噬菌體表面展示技術(shù)、細(xì)菌細(xì)胞表面展示技術(shù)、酵母表面展示技術(shù)、核糖體表面展示技術(shù)等?；驹硎抢肈NA重組技術(shù)，將目標(biāo)蛋白質(zhì)富集在噬菌體、細(xì)胞、核糖體等表面，其應(yīng)用主要體現(xiàn)在篩選蛋白與蛋白間的相互作用（唐雙焱等，2012）。

2.3 熒光篩選經(jīng)典的熒光篩選大多是結(jié)合酶的熒光底物或產(chǎn)物，通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化鑒定酶的活性。這種方法經(jīng)常結(jié)合微孔板（如96孔或384孔）進(jìn)行。熒光激活細(xì)胞分選（FACS）技術(shù)是將酶活性轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)的熒光信號(hào)，并與酶所在的細(xì)胞構(gòu)建聯(lián)系，從而實(shí)現(xiàn)酶活性與細(xì)胞熒光強(qiáng)度的偶聯(lián)。然后利用流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度信號(hào)變化，并通過(guò)給目標(biāo)細(xì)胞加上對(duì)應(yīng)的電荷，對(duì)不同的酶進(jìn)行分選收集（Cohen等，2001）。

3 定向進(jìn)化技術(shù)的應(yīng)用與展望

定向進(jìn)化技術(shù)極大地促進(jìn)了酶工程、代謝工程以及醫(yī)藥等很多領(lǐng)域的發(fā)展，在增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及底物特異性、改變或增強(qiáng)蛋白質(zhì)的活性等方面都取得了巨大的成果。

Liu等（2001）利用易錯(cuò)PCR、DNA改組并結(jié)合高通量的篩選方法提高了D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的活力和穩(wěn)定性，經(jīng)過(guò)篩選獲得突變株，其酶活力是野生型酶的10.5倍。張洪喜（2007）采用易錯(cuò)PCR技術(shù)、致突變菌株技術(shù)和使用雙層平板檢測(cè)法和液體酶活驗(yàn)證法對(duì)突變體庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得一株耐酸性突變體（Cel 18-7-12），最適pH為6.0。測(cè)序結(jié)果顯示，纖維素酶第339位的氨基酸由Ile變?yōu)門hr，并且發(fā)生終止突變?cè)斐蒀-末端25個(gè)氨基酸的缺失。馬安周（2008）利用易錯(cuò)PCR技術(shù)結(jié)合噬菌體展示系統(tǒng)進(jìn)行了纖維素酶的定向進(jìn)化。林凌（2009）采用易錯(cuò)PCR、DNA改組并結(jié)合平板篩選方法，得到了7株高活性突變株。其中內(nèi)切葡聚糖酶突變體M44-11，S75和S78水解羧甲基纖維素鈉的活性分別是野生型的2.03、2.54倍和2.68倍；此外，M44-11的酸堿耐受性和熱穩(wěn)定性也得到提高。Fujii等（2009）研究表明，對(duì)自養(yǎng)型假諾卡菌中VD3羥化酶通過(guò)隨機(jī)突變引入氨基酸置換，可以增加底物結(jié)合部位或催化劑的其他相關(guān)區(qū)域的適應(yīng)性，進(jìn)而提高其VD3羥化酶活性，試驗(yàn)最終獲得突變株的酶活比野生型菌株提高了6倍。Tao（2009）和Qin（2009）通過(guò)DNA改組的方法來(lái)提高鏈霉菌木聚糖酶B的熱穩(wěn)定性和耐堿性。最終獲得的最佳突變株在70℃可穩(wěn)定存在360 min，而野生型僅3 min就會(huì)損失50%的活性。另外，在pH 9.0的堿性緩沖液中的穩(wěn)定性也有所提高。Mchunu等（2009）采用易錯(cuò)PCR來(lái)提高真菌木聚糖酶的堿耐受性，最佳突變株在pH 10、溫度60℃的極端條件下存在90min后，仍能保持84%的活性，而野生型菌株在60min時(shí)只能保持22%的活性。王秀娟（2011）采用易錯(cuò)PCR方法，對(duì)工程菌WTCBHⅡ進(jìn)行定向進(jìn)化，得到了兩株酶活力是出發(fā)菌株所產(chǎn)酶活力3倍的突變菌株CBHⅡX16和CBHⅡX305。對(duì)工程菌WTCBHⅠ進(jìn)行定向進(jìn)化，得到了兩株酶活力是出發(fā)菌株所產(chǎn)酶活力2倍的突變菌株CBHⅠX88和CBHⅠX26。Liao等（2012）利用ep-PCR方法對(duì)植酸酶進(jìn)行進(jìn)化后，與出發(fā)菌相比，突變酶的比活力增強(qiáng)了61%，酶與底物親和力增加了53%，催化效率提高了84%。Liu等（2012）為獲得耐酸性的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶（BLA），利用ep-PCR對(duì)BLA進(jìn)行了定向進(jìn)化，相比較野生菌株，三個(gè)突變株在pH 4.5條件下的Kcat/Km值分別提高了3.5、6.0倍和11.3倍，且突變株更耐受低pH條件，同時(shí)其熱穩(wěn)定性沒(méi)有明顯改變。黃奮飛（2012）通過(guò)易錯(cuò)PCR與DNA改組技術(shù)，對(duì)EGⅠCDS進(jìn)行了隨機(jī)突變，并構(gòu)建了突變文庫(kù)，進(jìn)而對(duì)EGⅠ的熱穩(wěn)定性進(jìn)行定向進(jìn)化。得到了一個(gè)突變酶MutA19。其最適作用溫度為65℃，較野生型提高了20℃。45℃時(shí)突變酶與野生酶均可保持活力的穩(wěn)定；65℃時(shí)野生酶則迅速失去活力，而突變酶在60min內(nèi)仍可保持活力的穩(wěn)定。姜大磊（2012）采用DNA改組技術(shù)和平板篩選方法，得到了4株高活性突變酶。其中S1、S2、S3、S4的酶活力分別較野生型提高了5.75、4.78、3.19倍和3.61倍。張紅（2013）應(yīng)用易錯(cuò)PCR技術(shù)、細(xì)胞表面展示可控釋放體系和平板篩選方法，對(duì)源于梭菌屬的內(nèi)切纖維素酶CpCel 5A和CpCel 9進(jìn)行了定向進(jìn)化。劉敏（2013）通過(guò)易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)纖維素酶系進(jìn)行改造。將定向改造后的CbhA突變體G10和CenA-BGL突變體A12-H1整合到質(zhì)粒pET30a中，實(shí)現(xiàn)了整合得到的突變體降解纖維素酶，產(chǎn)生葡萄糖的比活（356.9 mU/mg）是野生型的2.7倍，其粗酶的相對(duì)活性（145.7 mU/ml）是野生型的8.2倍。曲瑩（2015）采用易錯(cuò)PCR技術(shù)和細(xì)胞表面展示-釋放系統(tǒng)對(duì)源于梭菌屬的內(nèi)切纖維素酶CpCel 5A進(jìn)行了定向進(jìn)化。利用96孔板高通量培養(yǎng)以及透明圈法來(lái)對(duì)構(gòu)建的纖維素酶突變庫(kù)進(jìn)行篩選。得到了一個(gè)高活力纖維素酶5D4。聶簡(jiǎn)琪等（2016）采用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)普魯蘭酶基因進(jìn)行定向進(jìn)化，利用高通量篩選方法實(shí)現(xiàn)了突變體文庫(kù)的快速高效篩選，并獲得了一株突變菌株4A4，其表達(dá)量提高了46.5%。梁艷莉（2016）應(yīng)用易錯(cuò)PCR技術(shù)、表面展示釋放系統(tǒng)和平板篩選方法，最終獲得兩株突變體3A11和5D4。與野生型相比，3A11對(duì)不溶性底物RAC的比活力提高了1.3倍，對(duì)可溶性底物CMC提高1.1倍。而5D4的酶活力分別對(duì)RAC和CMC降低了1.3、1.0倍。突變體3A11的最適pH值與野生型沒(méi)有明顯差異，均在5.0左右。

隨著蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)的快速發(fā)展，其已經(jīng)成為代謝工程與合成生物學(xué)不可或缺的工具，在人類健康、環(huán)境、能源等多個(gè)方面均具有重要的應(yīng)用。除了發(fā)展先進(jìn)的定向進(jìn)化技術(shù)外，開發(fā)高突變效率的進(jìn)化策略和易行通用的高通量篩選方法仍是未來(lái)蛋白質(zhì)定向進(jìn)化亟待解決的問(wèn)題。我們深信隨著這些定向進(jìn)化方法的更廣泛應(yīng)用，以及更多、更有效的進(jìn)化方法體系的建立，必將推動(dòng)生命科學(xué)的諸多領(lǐng)域突飛猛進(jìn)地向前發(fā)展，實(shí)現(xiàn)人類改造自然實(shí)踐的一次又一次飛躍。

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Directed evolution method has been a kind of new technology of protein modification developed in recent 20 years，which build mutant library through the gene mutation and restructuring，and then identified the performance improvement of mutants with high-throughput screening methods.This was the effective way to improve enzyme properties. This paper reviewed the several frequently-used methods of directed evolution and library screening after directed evolution of protein.In addition，the application of recombination for directed evolution and prospection for the future of this technology also described.

directed evolution；error prone PCR；DNA shuffling；directed screening

S816

A

1004-3314（2017）14-0015-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171404

國(guó)家自然科學(xué)基金（31360562、31160467、30960256、31260543）

*通訊作者