楊琳芬，符金華，姜文娟，邢磊，尹騰桂，董澤民，趙薇娜，樊晶，金海紅

（江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌330096）

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合譜庫(kù)檢索法同時(shí)測(cè)定飼料中4種黃曲霉毒素

楊琳芬，符金華*，姜文娟，邢磊，尹騰桂，董澤民，趙薇娜，樊晶，金海紅

（江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌330096）

本文建立了飼料中4種黃曲霉毒素（黃曲霉毒素AFB1、黃曲霉毒素AFB2、黃曲霉毒素AFG1、黃曲霉毒素AFG2）多殘留的液相色譜-三重四級(jí)桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（Qtrap-LC-MS/MS）的檢測(cè)方法。樣品前處理簡(jiǎn)單高效，經(jīng)過(guò)80%的乙腈水萃取后，再經(jīng)過(guò)SPE小柱凈化。結(jié)果表明：在濃度0.5～50 ng/mL時(shí)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995；添加濃度為1.0～20 ng/mL時(shí)，回收率為72.5%～95.7%。在市場(chǎng)上購(gòu)買了8種品牌飼料，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃曲霉毒素AFB1污染較為嚴(yán)重。該方法采用MRM定量的同時(shí)結(jié)合了譜庫(kù)檢索進(jìn)一步定性，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)定性和定量檢測(cè)分析，對(duì)于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)確定量檢測(cè)有著重要參考意義。

黃曲霉毒素；液相色譜；質(zhì)譜；EPI譜庫(kù)

霉菌毒素，又稱真菌毒素，是產(chǎn)毒真菌在一定環(huán)境條件下產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物。在所有霉菌毒素中，黃曲霉毒素的毒性、致癌性、污染頻率均居高首位，是毒性最強(qiáng)的天然物質(zhì)?？梢鹑祟惡蛣?dòng)物急性或慢性中毒，部分已證實(shí)具有致癌、致畸、致細(xì)胞突變的“三致”作用（朱聰英等，2010；楊靜等，2009）。黃曲霉毒素對(duì)飼料質(zhì)量有嚴(yán)重的影響，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物中毒、白細(xì)胞缺乏癥等，還會(huì)引起腎中毒、肝中毒、生殖異常以及抑制免疫反應(yīng)，給畜牧業(yè)發(fā)展和畜產(chǎn)品安全造成極大的危害。因此，我國(guó)對(duì)飼料中各種黃曲霉毒素的限量有著嚴(yán)格要求（GB 2761-2011），最低限量已達(dá)0.5 μg/kg。

目前有關(guān)毒素的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫法（ELISA）、薄層色譜法（TLC）、液相色譜法（HPLC）、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）等（朱聰英等，2010；楊靜等，2009；魏麗莉，2008；Chiar等，2005；鮑蕾等，2005），這些方法在一定程度上解決了黃曲霉毒素的檢測(cè)方法問(wèn)題，但是存在諸多問(wèn)題，其中免疫學(xué)法通常作為篩選方法，不能準(zhǔn)確定量，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性；液相色譜法容易受到基質(zhì)干擾，且檢測(cè)限很難達(dá)到限量標(biāo)準(zhǔn)的要求；氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法往往需要衍生化等步驟，操作繁瑣。以上方法無(wú)法對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量，因此不能作為最終的確證方法。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）是一種集高效分離和多組分定性、定量于一體的系統(tǒng)，對(duì)沸點(diǎn)高、不易揮發(fā)和熱不穩(wěn)定化合物的分離和鑒定具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，成為近年來(lái)分析化學(xué)中發(fā)展非?？斓男录夹g(shù)之一（Markus等，2012；Johannes等，2012；Mira等，2010）。并且該方法檢測(cè)時(shí)無(wú)需衍生化，操作簡(jiǎn)單、省時(shí)，能夠在保證靈敏度的情況下仍可以達(dá)到在目標(biāo)范圍內(nèi)未知化合物篩選的目的。該方法已成為近年來(lái)分析檢測(cè)黃曲霉毒素的主要方法，并且已經(jīng)應(yīng)用到黃曲霉毒素的污染檢測(cè)當(dāng)中（Micheal等，2009）。

然而，隨著HPLC-MS/MS應(yīng)用的不斷深入和成熟，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在分析檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)樣品中的化合物時(shí)，除了具有較強(qiáng)抗基體干擾能力、高通量、高選擇性、高靈敏度的同時(shí)，也逐步發(fā)現(xiàn)該技術(shù)的一些不足之處。譬如：由于基質(zhì)的復(fù)雜性，會(huì)影響目標(biāo)物的離子比例發(fā)生較大變化，從而導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果為假陰性（Trufelli等，2011）。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿/線性離子阱質(zhì)譜方法，該方法具有從多級(jí)反應(yīng)檢測(cè)（MRM）-信息依賴性采集（IDA）-增強(qiáng)子離子掃描（EPI）-譜庫(kù)檢索的獨(dú)有檢測(cè)模式，該模式原理為：當(dāng)MRM信號(hào)超過(guò)設(shè)定的閾值（根據(jù)IDA進(jìn)行設(shè)置）時(shí)，MRM與EPI會(huì)交替進(jìn)行掃描。因此，既可以得到MRM的譜圖，也可以得到EPI二級(jí)質(zhì)譜的全部碎片信息，即該化合物的指紋圖譜，進(jìn)一步譜庫(kù)檢索達(dá)到同時(shí)定性和定量的目的。目前，國(guó)內(nèi)外單獨(dú)建立黃曲霉毒素的LC-MS/MS譜的較少，本文以4種黃曲霉毒素為例，建立了4種黃曲霉毒素的LC-MS/MS譜庫(kù)，并且利用譜庫(kù)檢索建立了快速定性和定量分析4種黃曲霉毒素的液相色譜-三重四級(jí)桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（Qtrap-LC-MS/MS）的檢測(cè)方法。該方法在準(zhǔn)確定量和定性分析飼料中黃曲霉毒素和保證飼料安全品質(zhì)方面具有重要的參考意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器和試劑質(zhì)譜型號(hào)為Sciex4500 Qtrap（美國(guó)Sciex公司）；液相為島津LC-20AD XR（日本Shimadzu公司）；3k30離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；MS 3D S25微量振蕩器（德國(guó)IKA公司）；NEVAPTM111氮吹儀（美國(guó)Organomation Associates Inc公司）；固相萃取裝置（SPE，美國(guó)Supelco公司）；METTLER TOLEDO XP 205天平；

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別精密稱取5.0 mg黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2對(duì)照品，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋定容，即為50 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，置于-18℃冰箱中保存。分別吸取0.2 mL上述標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液于10 mL的棕色容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，即為1.0 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，冷藏保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法液相色譜法：色譜柱為Kinetex C18，2.6 μm，2.1×100 mm（品牌為phenomenex）；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積1 μL；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈；洗脫程序見表1。

表1 洗脫梯度

質(zhì)譜條件：多級(jí)反應(yīng)檢測(cè)（MRM）掃描，ESI離子源；氣簾氣30 psi；霧化氣55 psi；輔助霧化器55 psi；溫度550℃；噴霧電壓5500 V；氣體均為氮?dú)?；MRM離子對(duì)見表2；當(dāng)MRM響應(yīng)值大于200 cps時(shí)同時(shí)啟動(dòng)線性離子阱的EPI功能。EPI掃描范圍：50～350 Da；掃描速度10000 Da/s；動(dòng)態(tài)填充時(shí)間小于5 ms。

1.3 樣品前處理稱?。?±0.1）g飼料樣品于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL 80%的乙腈水溶液，渦旋2 min，劇烈震蕩10 min，離心取上清液，重復(fù)提取一次合并上清液；在合并提取液中加入10 mL正己烷渦旋1 min，待靜止分層，去掉上清液，重復(fù)去脂一次；然后蒸干，用5 mL水復(fù)溶待凈化；復(fù)溶液用SPE小柱凈化，控制流速2 mL/min左右，抽干，搜集流出液，在60℃下氮?dú)獯蹈?，? mL 0.1%的甲酸水（10%的甲醇）復(fù)溶，渦旋5 s，過(guò)0.22 μm濾膜上機(jī)測(cè)試。

表2 MRM離子對(duì)列表（1是定量離子）

1.4 LC-MS/MS譜庫(kù)的建立實(shí)驗(yàn)分別采用低、中、高3種不同能量（20、35、50 eV）和擴(kuò)展能量CES（35±15）對(duì)4種黃曲霉毒素進(jìn)行EPI掃描，并且用Access編寫4種黃曲霉毒素LC-MS/MS數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的檢出限、回收率、重復(fù)性以及線性范圍將4種黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用空白基質(zhì)依次稀釋成0.5～50 ng/mL的系列濃度進(jìn)行測(cè)定。將測(cè)得的各種毒素的峰面積的平均值Y與所對(duì)應(yīng)的濃度X（ng/mL）做回歸曲線，求得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r），外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，4種毒素在濃度0.5～50 ng/mL有著良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.995；在1.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL（n=3）4個(gè)不同濃度添加水平下做了回收率實(shí)驗(yàn)，回收率分別是72.5%、80.6%、88.9%、95.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）均小于5.9%；4種毒素的檢出限（信噪比大于3）和定量限（信噪比大于10）結(jié)果見表3。

表3 方法的檢出限、回收率、重復(fù)性以及線性范圍

2.2 質(zhì)譜分析檢測(cè)實(shí)驗(yàn)采用蠕動(dòng)泵注射50 ng/mL的4種毒素混標(biāo)溶液，在正離子模式做一級(jí)母離子掃描，得到4種化合物的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，然后采用子離子掃描得到化合物的子離子，在MRM模式下優(yōu)化化合物去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE），優(yōu)化結(jié)果見表2。為了達(dá)到同時(shí)定性和定量的目的，本實(shí)驗(yàn)采用了MRM-IDA-EPI-譜庫(kù)檢索智能化的多步模式。首先結(jié)合Qtrap的線性離子阱功能，從MRM模式（圖1）獲得化合物的保留時(shí)間、峰面積、離子比率等信息，在通過(guò)EPI掃描獲得二級(jí)質(zhì)譜圖，利用已經(jīng)建立好的譜庫(kù)進(jìn)行檢索。這種模式對(duì)化合物結(jié)構(gòu)的確認(rèn)有很大幫助。

圖1 四種黃曲霉毒素在混標(biāo)濃度為2 ng/mL的色譜圖

采用該方法對(duì)實(shí)際陽(yáng)性可疑樣品進(jìn)行檢測(cè)，獲得其MRM圖，然后采用EPI圖進(jìn)行譜庫(kù)檢索。其中Fit值（匹配度）是用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)EPI與可疑樣品譜圖進(jìn)行比較后得到的匹配度，滿分為100分，F(xiàn)it值越大說(shuō)明該化合物的可能性越大；RevFit值（反相匹配度）是用可疑樣品譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品的EPI圖進(jìn)行對(duì)比后獲得的匹配度；Purity值（純度值）是綜合前兩種的結(jié)果得出的數(shù)值，所有的匹配結(jié)果可以進(jìn)行排序。從圖1可知該化合物是黃曲霉毒素B1（AFB1）。

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)采用建立好的方法進(jìn)行樣品分析檢測(cè)，在市場(chǎng)上隨機(jī)購(gòu)買8種不同品牌的飼料進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品普遍存在黃曲霉毒素的污染，尤其是黃曲霉毒素B1污染較為嚴(yán)重，結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能滿足我國(guó)對(duì)飼料中黃曲霉毒素污染進(jìn)行監(jiān)控的需要。

表48 種飼料樣品中黃曲霉毒素的含量（N/A表示未檢出）μg/kg

3 結(jié)論

本文建立了飼料中4種黃曲霉素毒素的高效液相色譜-三重四級(jí)桿/離子阱質(zhì)譜的分析方法，結(jié)合自建的4種黃曲霉毒素LC-MS/MS標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)，采用MRM-IDA-EPI-譜庫(kù)檢索的多步模式，成功實(shí)現(xiàn)了4種毒素的快速定性和定量分析。該方法前處理簡(jiǎn)單、快速、回收率高、準(zhǔn)確度高、方法穩(wěn)定性好，可滿足對(duì)飼料中黃曲霉毒素的殘留檢測(cè)分析要求。

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In this paper，we established 4 kinds of Aspergillus flavus toxin in the feed（Aspergillus flavus toxin AFB1，aflatoxin AFB2，Aspergillus flavus toxin AFG1，Aspergillus flavus toxin AFG2）multi residue liquid phase chromatography triple four rod/linear ion trap tandem detecting method of mass spectrometry（Qtrap-LC-MS/MS）.The samples pretreatment was simple and efficient.The samples were extracted by 80%acetonitrile water and purified by SPE column.The results showed that in the concentration of 0.5～50 ng/mL linear good，the correlation coefficient was greater than 0.995；the concentration of 1～20 ng/mL，the recovery rate of 72.5%～95.7%.In the market to buy 8 kinds of brand feed，the experimental results show that aflatoxin B1pollution was more serious.The method adopts MRM quantitative analysis and combines with the further qualitative analysis of the spectral library search.It can realize both qualitative and quantitative analysis.It has important reference value for the accurate and quantitative detection of the conventional laboratory.

aflatoxin；liquid chromatography；mass spectrometry；EPI library

S816.17

A

1004-3314（2017）14-0028-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171407

*通訊作者