劉二龍，盧麗，呂英姿，蔣湘，李嘉琪，林學(xué)勤，杜雅萍，鄭高彬

（1.黃埔出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東廣州510730；2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東廣州510623）

轉(zhuǎn)基因苜蓿草KK179-2品系特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的建立

劉二龍1*，盧麗2，呂英姿1，蔣湘1，李嘉琪1，林學(xué)勤1，杜雅萍1，鄭高彬1

（1.黃埔出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東廣州510730；2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東廣州510623）

根據(jù)轉(zhuǎn)基因低木質(zhì)素苜蓿草品系KK179-2 5’端外源插入序列與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區(qū)序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立了KK179-2品系特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，并對其特異性、靈敏度及可重復(fù)性進(jìn)行了測定。結(jié)果表明：建立的定量實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法特異性良好；標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.99，擴(kuò)增效率E為105%；檢測限為20拷貝，定量限為200拷貝。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)顯示本方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）都在可接受范圍內(nèi)。綜上，建立的KK179-2品系特異性定量PCR檢測方法適于快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定地對轉(zhuǎn)基因苜蓿草KK179-2品系進(jìn)行檢測。

轉(zhuǎn)基因苜蓿KK179-2；品系特異性；定量實(shí)時(shí)熒光PCR

苜蓿是美國繼玉米、小麥、大豆后第四大農(nóng)作物，因其蛋白質(zhì)含量約占總干草質(zhì)量的17%～20%，是一種重要的飼料作物。轉(zhuǎn)基因苜蓿KK179-2是由孟山都公司和Forage Genetics International（FGI）共同開發(fā)的轉(zhuǎn)基因低木質(zhì)素苜蓿品種，商品名為HarvXtraTM。KK179-2于2014年11月10日獲得美國農(nóng)業(yè)部（USDA）動植物衛(wèi)生檢疫局（APHIS）批準(zhǔn)可在美國種植。目前批準(zhǔn)用于食品及加工產(chǎn)品的國家為澳大利亞、加拿大、日本、墨西哥、新西蘭、韓國、美國七個(gè)國家（山東草業(yè)網(wǎng)，2014；Clive等，2014；國家質(zhì)檢總局，2014）。木質(zhì)素是維管植物細(xì)胞壁的重要組成成分，由于苜蓿木質(zhì)素不易被消化，因而降低了苜蓿的營養(yǎng)價(jià)值，轉(zhuǎn)基因苜蓿品系KK179-2與傳統(tǒng)苜蓿相比，木質(zhì)素最高可減少22%（ISSSA，2017；Health，2015）。2014年5月1日澳新食品標(biāo)準(zhǔn)局（FSANZ）批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因苜蓿KK179-2可用于食品。KK179-2目前尚未獲得我國農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物安全證書。

低木質(zhì)素的苜蓿品系KK179-2在苜蓿基因組中插入了咖啡酰CoA甲基轉(zhuǎn)移酶（CCOMT）編碼序列（CCOMT是參與G型木質(zhì)素生物合成路徑的酶），該片段引入的方式為反向重復(fù)序列，表達(dá)時(shí)可以產(chǎn)生雙鏈RNA，從而產(chǎn)生RNA干擾（RNAi），抑制內(nèi)源CCOMT RNA的翻譯及CCOMT酶的水平，導(dǎo)致KK179-2的G木質(zhì)素含量降低進(jìn)而減少苜蓿木質(zhì)素整體含量（ISSSA，2017；Health，2015；藺占兵等，2003）。

隨著國內(nèi)對高品質(zhì)牛奶需求的增強(qiáng)，目前我國進(jìn)口苜蓿量逐年增加，轉(zhuǎn)基因監(jiān)管的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增大。國內(nèi)和歐盟暫未出臺KK179-2的官方檢測方法。本研究基于KK179-2的5’端外源插入片段與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區(qū)序列建立了轉(zhuǎn)基因苜蓿KK179-2品系特異性TaqMan實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法，以滿足轉(zhuǎn)基因苜蓿KK179-2品系標(biāo)識的需求。

1 材料與方法

1.1 材料轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162，轉(zhuǎn)基因玉米品系89034，轉(zhuǎn)基因玉米品系NK63，轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11，轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2，轉(zhuǎn)基因大米Bt63，非轉(zhuǎn)基因大葉苜蓿、小麥、油菜籽、轉(zhuǎn)基因苜蓿J101和轉(zhuǎn)基因苜蓿J163由本實(shí)驗(yàn)室購置及儲備。轉(zhuǎn)基因苜蓿KK179-2的陽性質(zhì)粒由苜蓿內(nèi)源基因acc部分片段和KK179-2的5’邊界序列共586 bp克隆入PUC57載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞TOP10進(jìn)行保存。

1.2 試劑Premix Ex TaqTM（TaKaRa）；引物和探針由英濰捷基公司合成，稀釋成終濃度為10 μmol/L的工作液使用。植物DNA提取試劑盒DP302、質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自天根公司。

1.3 儀器ABI7500，ABI75000FAST實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）、微量分光光度計(jì)（nanodrop2000c，美國）、研磨機(jī)（IKA，德國）。

1.3 方法

1.3.1 植物材料以及混合樣品基因組DNA的提取與純化按照天根DNA提取試劑盒操作說明書提取DNA，用微量分光光度計(jì)nanodrop2000c測定其濃度。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物和探針設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)基因苜蓿KK179-2外源插入片段元件組成及序列見圖1和圖2（ISSSA，2017）。

圖1 轉(zhuǎn)基因苜蓿KK179-2品系外源插入片段示意圖

圖2 KK179-2 5’端鄰接區(qū)序列及引物探針在序列上的位置

基于KK179-2苜蓿5’端外源插入片段與苜蓿基因組DNA之間的鄰接區(qū)序列，使用Primer-EXpress 3.0軟件（AppliedBiosystems，USA）設(shè)計(jì)引物和探針。并將設(shè)計(jì)的引物和探針在NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，確定引物和探針理論上的特異性。內(nèi)源基因acc（acetyl CoA carboxylase）（Alexander，2007）引物和探針用于檢測苜蓿樣品基因組DNA是否成功提取以及是否適于進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。序列信息詳見表1。

表1 引物和探針序列

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光PCR檢測反應(yīng)體系為20 μL：Premix Ex Taq TM 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，探針0.6 μL，DNA模板1 μL和ddH2O 7.4 μL。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的反應(yīng)程序?yàn)椋篠tage1：預(yù)變性95℃30 s；Stage 2：95℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)，于60℃收集熒光信號。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的特異性提取轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162，轉(zhuǎn)基因玉米品系89034，轉(zhuǎn)基因玉米品系NK63，轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11，轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2，轉(zhuǎn)基因大米Bt63，非轉(zhuǎn)基因大葉苜蓿、小麥、油菜籽、轉(zhuǎn)基因苜蓿J101，轉(zhuǎn)基因苜蓿J163和KK179-2陽性質(zhì)粒的DNA，利用1.2.3體系和參數(shù)進(jìn)行特異性檢測。

1.2.5 KK179-2的靈敏度測試及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立將KK179-2質(zhì)粒DNA溶液用TE緩沖液梯度稀釋至2×107～2×100拷貝/μL共8個(gè)濃度，按1.2.3實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)濃度設(shè)置9個(gè)平行重復(fù)，以Ct≤36，且其RSD≤25%的最低稀釋度為定量下限（LOQ）。能100%檢出的最低稀釋度為檢測下限（LOD）。并由以上濃度梯度建立KK179-2品性特異性實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，其擴(kuò)增效率要求為90%～110%，R2≥0.98。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測KK179-2的可重復(fù)性測試將1.2.5中的2×105～2×102拷貝/μL 4組不同濃度的DNA擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）以進(jìn)行可重復(fù)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和探針設(shè)計(jì)及體系建立對多組品系特異性引物和探針的反應(yīng)效率、擴(kuò)增曲線和擴(kuò)增效果進(jìn)行篩選和分析，最終選擇KK179-2-F/R/P引物和探針的序列見表1。

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測KK179-2的特異性測試采用acc-1/2/p引物和探針對1.2.4中所有提取的材料DNA樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，只有苜蓿類的非轉(zhuǎn)基因大葉苜蓿、轉(zhuǎn)基因苜蓿J101、轉(zhuǎn)基因苜蓿J163和KK179-2質(zhì)粒DNA來源的模板出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他無典型擴(kuò)增曲線，表明苜蓿內(nèi)源基因acc擴(kuò)增結(jié)果正確（圖3 A），提取DNA模板質(zhì)量符合實(shí)時(shí)熒光PCR要求。

采用KK179-2品系特異性引物和探針對1.2.4中12種材料所提取的DNA樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增時(shí)，只有KK179-2質(zhì)粒來源的DNA模板有典型熒光擴(kuò)增曲線，其他作物的DNA模板均無典型擴(kuò)增曲線（圖3 B）。說明本方法可特異性檢測KK179-2。

2.3 KK179-2的靈敏度測試及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立將提取的KK179-2質(zhì)粒DNA用TE緩沖液梯度稀釋至2×107～2×100拷貝/μL進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果如表2所示。當(dāng)模板量為200拷貝時(shí)，9個(gè)平行擴(kuò)增反應(yīng)均出現(xiàn)擴(kuò)增，Ct值≤36，且標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）值為0.4，模板量為2拷貝時(shí)，無擴(kuò)增曲線，所以本文建立的KK179-2品系特異性熒光PCR檢測方法的定量下限LOQ為200拷貝的KK179-2質(zhì)粒DNA，LOD為20拷貝的KK179-2質(zhì)粒DNA。

圖3 實(shí)時(shí)熒光PCR特異性測試

以2×107～2×100拷貝KK179-2質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，建立KK179-2品系特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=-3.2086x+42.426，線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.99，擴(kuò)增效率E為105%（圖4C，D），表明標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，擴(kuò)增效率良好，且標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2大于0.98，均符合定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)及擴(kuò)增效率的要求（Engl，2014；Alexander，2007），因此說明本文建立的方法在2×107～2×100拷貝線性區(qū)間內(nèi)適合于KK179-2的定量分析。

2.4 重復(fù)性測試由表2可知，4個(gè)10倍稀釋濃度梯度2×105～2×102拷貝的KK179-2陽性質(zhì)粒DNA進(jìn)行的擴(kuò)增結(jié)果表明，4組9次平行重復(fù)Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）為0.06～0.15，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.18%～0.53%，均在可接受的范圍之內(nèi)，表明本文建立的轉(zhuǎn)基因苜蓿KK179-2品系特異性實(shí)時(shí)熒光PCR方法具有很好的可重復(fù)性。

圖4 KK179-2品系特異性靈敏度測試擴(kuò)增圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測KK179-2品系的重復(fù)性和靈敏度

3 討論

目前我國奶牛存欄數(shù)為1500萬頭，而國內(nèi)的苜蓿產(chǎn)量及質(zhì)量，不能滿足生產(chǎn)高檔牛奶的需求，苜蓿進(jìn)口量逐年攀升。轉(zhuǎn)基因苜蓿通過飼料進(jìn)入動物養(yǎng)殖的食物鏈，對食品安全存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。為保障消費(fèi)者的知情權(quán)，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度在30多個(gè)國家和地區(qū)應(yīng)用，中國目前實(shí)施無閥值的強(qiáng)制性標(biāo)識制度（Chief Medical Officer of the RussianFederation，2014；Gang等，2008；ECNO. 1829，2003；APEC-JIRCAS，2001；Ministry of Agriculture and Forestry of South Korea，2000）。

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度的實(shí)施需要建立相應(yīng)檢測方法作為支撐。品系特異性檢測方法是基于外源插入片段和宿主基因接合區(qū)的邊界序列建立的檢測方法，目前被認(rèn)為是最適合轉(zhuǎn)基因標(biāo)識的檢測判定方法（Gang等，2008；Zimmermann，2000）。與其他篩選啟動子、終止子、抗生素標(biāo)記基因和轉(zhuǎn)入目的基因不同，品系特異性檢測方法具有很高的特異性，對于相同質(zhì)粒構(gòu)建的不同品系也能很好的區(qū)分（Taverniers，2001）。目前已有多種轉(zhuǎn)基因作物品系如大豆、油菜、棉花、水稻和轉(zhuǎn)基因苜蓿等建立了相關(guān)的品系特異性檢測方法（劉二龍等，2015；劉欣等，2015；汪秀秀等，2014；蔣利平等，2013；Gang等，2008）。

目前對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測應(yīng)用最廣泛的是熒光PCR檢測技術(shù)，相較普通PCR，其具更高的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性?？赏ㄟ^熒光信號的積累實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，而后通過擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定性或定量分析。

本文根據(jù)轉(zhuǎn)基因苜蓿品系KK179-2 5’端外源插入序列與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區(qū)序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立的轉(zhuǎn)基因苜蓿KK179-2品系特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確，適用于對轉(zhuǎn)基因苜蓿KK179-2進(jìn)行品系特異性篩查，可為進(jìn)境轉(zhuǎn)基因苜蓿的監(jiān)管提供有力技術(shù)支撐。

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To establish event-specific quantitative TaqMan real time PCR detection methods for genetically modified（GM）low-lignin alfalfa events KK179-2 the specific primer pairs and probe based on the 5’insert-to-plant junction sequence spanning the alfalfa genomic DNA and transgene insert DNA of KK179-2 were designed.The specificity，sensitivity and repeatability of this method were analyzed.Results showed that the developed quantitative realtime PCR detection method was specific for KK179-2.The correlation coefficient of standard curve was 0.99 and the efficiency of real time PCR was 105%.The limit of quantification（LOQ）and limit of detection（LOD）of this assay were 200 copies and 20 copies of KK179-2 plasmid DNA，respectively.Repeatability test of the established event-specific real time PCR method showed that the standard deviation（SD）and the relative standard deviation（RSD）were all in the acceptable range.Therefore，the established event-specific quantitative real time PCR method was suitable for fast，accurate and stable detection of GM alfalfa KK179-2.

genetically modified alfalfa KK179-2；event-specific；quantitative real time PCR

S816.17

A

1004-3314（2017）14-0031-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171408

廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局科技項(xiàng)目（2017GDK41、2016GDK60）

*通訊作者