庫亞萍 周盛年

(山東大學醫(yī)學院附屬齊魯醫(yī)院神經內科，山東 濟南 250012)

丁苯酞注射液對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用及半胱氨酸蛋白酶-3表達的影響

庫亞萍1周盛年

(山東大學醫(yī)學院附屬齊魯醫(yī)院神經內科，山東 濟南 250012)

目的 探討丁苯酞(NBP)注射液對大鼠局灶性腦缺血再灌注(IR)損傷的保護作用及半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3表達的影響。方法 清潔級健康SD大鼠60只，按照隨機數(shù)字表法分成假手術組(Sham組)、IR組以及NBP組各20只，另將NBP組根據(jù)NBP的用藥劑量分成小劑量組(20 mg/kg)6只、中劑量組(40 mg/kg)7只、大劑量組(80 mg/kg)7只。采用Zea-longa線栓法制作大鼠局灶性IR模型，對比各組大鼠的腦梗死體積及凋亡細胞數(shù)，各組大鼠的caspase-3表達以及NBP組大鼠經不同劑量NBP處理后的caspase-3表達。結果 NBP組和IR組腦梗死體積及凋亡細胞數(shù)均明顯高于Sham組，NBP組明顯低于IR組(P<0.05)。NBP組和IR組皮質和海馬的caspase-3陽性細胞數(shù)均明顯多于Sham組，NBP組明顯少于IR組(P<0.05)。中劑量及大劑量組皮質和海馬的caspase-3陽性細胞數(shù)均明顯少于小劑量組，大劑量組明顯少于中劑量組(P<0.05)。結論 NBP對于大鼠局灶性IR損傷具有較好的保護作用，還可有效降低caspase-3的表達，值得臨床重視。

丁苯酞注射液；局灶性腦缺血再灌注損傷；半胱氨酸蛋白酶-3

凋亡是造成腦缺血再灌注(IR)損傷的一個重要原因，細胞凋亡的主要機制在于腦神經細胞發(fā)生缺血缺氧現(xiàn)象之后，其細胞能量代謝作用出現(xiàn)障礙，進而生成凋亡刺激因子，并介導相關蛋白級聯(lián)反應〔1〕。有研究提示半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3類型抑制劑可以作為IR損傷的一項新型治療藥物〔2〕。臨床通常將丁苯酞(NBP)作為腦保護劑用于治療IR損傷，發(fā)現(xiàn)其療效較滿意，該藥物對腦的保護機制仍需進一步研究。本文擬分析NBP注射液對大鼠局灶性IR損傷的保護作用及caspase-3表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇在我院實驗室所飼養(yǎng)的清潔級健康SD雄性8 w齡大鼠60只，體質量200～260 g，平均(235.68±15.23)g。按照隨機數(shù)字表法分為假手術組(Sham組)、IR組及NBP組各20只，另將NBP組根據(jù)NBP的用藥劑量分成小劑量組(20 mg/kg)6只，中劑量組(40 mg/kg)7只，大劑量組(80 mg/kg)7只。試劑與儀器：一抗：兔抗caspase-3多克隆抗體(英國Abcam公司，批號：ab2302)。二抗及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；TTC試劑購于美國的Sigma公司；TUNEL試劑盒購于德國的羅氏公司；石蠟切片機和光學顯微鏡購于日本的Olympus公司；熒光定量PCR儀選擇德國生產的Rotor-Gene 3000型。

1.2 方法

1.2.1 制作動物模型 IR組及NBP(石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司生產，生產批號：050302)組的大鼠予以10%的水合氯醛行腹腔注射，待其麻醉之后按Zea-longa線栓法〔3〕的步驟制作大鼠右側腦部中動脈的局灶性IR模型。而Sham組只分離大鼠的右側頸總、頸外及頸內動脈，無需插入線栓。IR組及NBP組在缺血2 h后移除線栓而后再灌注約24 h。NBP組中的高、中、低劑量亞組在缺血2 h并拔線之后立刻予以80 mg/kg、40 mg/kg、20 mg/kg的NBP注射液行1次腹腔注射，IR組和Sham組可注射等量的生理鹽水，上述步驟的實驗過程均需滿足動物倫理學的規(guī)范。

1.2.2 腦梗死體積的檢測 每組大鼠麻醉后斷頭取腦，并在-20℃的冰箱內速凍約15 min，而后行2 mm厚冠狀位切片共5片，放置在2%的(TTC)溶液內，于37℃的恒溫箱孵育約30 min，利用4%的多聚甲醛進行固定，最后用數(shù)碼相機拍照并通過圖像分析軟件對腦梗死體積的百分比進行計算。其中腦梗死體積的百分比=右側腦梗死的面積×切片的厚度/右側腦組織的總體積×100%。

1.2.3 凋亡細胞數(shù)的檢測 利用TUNEL法進行檢測，麻醉后將大鼠開胸并暴露心臟，自心尖插進粗針頭，而后剪開右心耳使其開放靜脈血，利用生理鹽水迅速進行心臟灌流，待右心耳有清液流出之后利用4%的多聚甲醛行灌流固定，之后快速斷頭取腦，利用4%的多聚甲醛給予24 h固定。在視交叉后約2 mm位置切取3 mm冠狀位腦部組織塊，進行常規(guī)包埋，而后切取4 μm厚的腦片。將石蠟切片脫蠟至水，用3%的過氧化氫溶液封閉約10 min，在復合消化酶液及37℃的條件下消化約20 min，再滴入TUNEL混合液，放于37℃下1 h靜置。滴入過氧化物酶(POD)轉化液，在37℃下反應約40 min，經DAB顯色和蘇木精復染后以中性樹膠封片。其中TUNEL陽性細胞的判定：細胞核有固縮濃染，且呈深棕色，相關細胞體積變小，形狀不規(guī)則。將每張切片放在高倍顯微鏡下選擇5個視野，對陽性細胞進行計數(shù)，最后取平均值。

1.2.4 caspase-3表達的檢測 制備石蠟切片后實施caspase-3的免疫組化染色，利用SP法進行檢測。一抗是兔抗caspase-3的多克隆抗體(產自英國的Abcam公司)，二抗及DAB顯色劑產自福州的邁新生物公司。在染色后位于細胞質(核)內的棕黃色顆粒即為caspase-3陽性表達的細胞，將每張切片放置在400倍的顯微鏡下，分別在右側大腦半球的缺血半暗帶區(qū)的皮質及海馬區(qū)隨機選擇10個視野，對陽性細胞進行計數(shù)，而后去平均值。

1.3 觀察指標 對比各組大鼠的腦梗死體積及凋亡細胞數(shù)，各組大鼠的caspase-3表達及NBP組大鼠經不同劑量NBP處理后的caspase-3表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠腦梗死體積及凋亡細胞數(shù)比較 NBP組和IR組的腦梗死體積〔(30.48±10.11)%、(40.17±12.89)%〕及凋亡細胞數(shù)〔(29.26±2.38)個/HP，(46.69±2.95)個/HP〕均明顯高于Sham組(P<0.05)，NBP組均明顯低于IR組(P<0.05)。

2.2 各組大鼠caspase-3表達對比 NBP組和IR組皮質(7.55±2.51，11.78±4.02)和海馬(31.18±5.82，42.73±9.20)的caspase-3陽性細胞數(shù)均明顯多于Sham組(1.53±1.15，3.56±1.53)(P<0.05)，NBP組均明顯少于IR組(P<0.05)。

2.3 經不同劑量NBP處理后的caspase-3表達 中劑量及大劑量組皮質(7.69±1.15，4.38±2.46)和海馬(30.65±2.33，28.20±1.68)的caspase-3陽性細胞數(shù)均明顯少于小劑量組(9.48±1.12，33.49±1.39)，大劑量組明顯少于中劑量組(P<0.05)。

3 討 論

通過不斷開展有關缺血性腦血管類疾病發(fā)病機制以及治療方法方面的研究，該病臨床治療方面進展較快，認為需針對腦部受損血管以及細胞兩方面機制進行聯(lián)合治療，其中溶栓治療就是對于血管損傷的一項針對性療法〔4〕。而IR損傷為缺血性腦血管類疾病的一項重要病理生理性階段，IR損傷發(fā)病原因十分復雜，其會以氧化應激以及炎癥反應和細胞凋亡等形式對神經細胞造成損傷甚至死亡，發(fā)病機制主要分為自由基受損和細胞凋亡以及鈣超載等多種學說。經過多項腦缺血式動物模型實驗研究發(fā)現(xiàn)，可以通過形態(tài)學、生化以及基因學等多個維度進行證實，在IR損傷過程中的各重要階段均伴有細胞凋亡現(xiàn)象〔5〕。因此，對IR損傷進行有效抑制是缺血性腦血管類疾病臨床治療的關鍵，同時，保護腦部神經系統(tǒng)，防止細胞凋亡是該類治療的重點所在。

本研究符合趙秀芹等〔6〕的報道結果，提示有IR損傷的大鼠腦梗死體積和凋亡細胞數(shù)均更多，而經過NBP處理后均明顯減少。筆者認為原因主要可能與NBP的腦保護作用有關。NBP注射液的活性成分為NBP，是從芹菜籽內所提取發(fā)現(xiàn)，通過人工合成而得的消旋類化合物，其結構與天然芹菜籽內的左旋芹菜甲素一致。臨床研究發(fā)現(xiàn)，NBP對缺血性腦卒中起到修復中樞損傷效果，有助于改善患者受損神經，通常將其用于治療因急性缺血性腦卒中而發(fā)生的神經功能受損〔7〕。同時，多項動物藥效學相關研究均證實，NBP能夠對缺血性腦卒中造成的腦損傷多項病理階段起到有效阻斷作用，并可以抑制腦缺血，減小大鼠發(fā)生缺血性腦梗死總面積，降低腦水腫程度，且對腦能量代謝以及腦血血區(qū)域內的微循環(huán)和血流動力學情況產生改善作用〔8〕。此外，該藥物還可以起到保護腦神經，防止其因IR而受損的效果。其對IR受損腦神經系統(tǒng)的保護及修復，主要是以對細胞凋亡通路進行干擾的方式來完成。通過抑制細胞凋亡類調控基因正常表達，來獲得抑制神經細胞發(fā)生凋亡作用的效果。同時，本文符合王鵬等〔9〕的報道結果，提示caspase-3參與到了大鼠的IR損傷過程中，且caspase-3陽性細胞數(shù)越少，則IR損傷的病情越輕。原因主要與caspase-3的凋亡調控路徑有關。細胞凋亡在IR損傷多個環(huán)節(jié)均有參與，并且是腦神經功能受損的根本原因。因此，抑制腦神經細胞大量凋亡是治療IR損傷的關鍵。其凋亡根本分子機制為，腦神經細胞發(fā)生缺血以及缺氧，進而出現(xiàn)能量代謝障礙，生成多種凋亡刺激類因子，例如自由基以及一氧化氮等。在上述刺激因子共同作用之下，和凋亡有關的基因會介導發(fā)生蛋白級聯(lián)反應。目前已經證實，caspase依賴途徑為非常關鍵的一種凋亡路徑，其中caspase-3為該級聯(lián)中最重要的一種凋亡蛋白酶〔10〕。同時，caspase-3除了為細胞凋亡過程中發(fā)生級聯(lián)反應一項必經之路外，還是凋亡的一個關鍵酶以及執(zhí)行者。因此，caspase-3在整個IR損傷中發(fā)生神經細胞凋亡情況的關鍵，臨床使用caspase-3相關抑制劑治療，可作為新的治療方向。

本文還提示隨著NBP用藥劑量的增大，大鼠caspase-3陽性細胞數(shù)的表達也明顯減少。原因主要是因為NBP的應用明顯改善了大鼠的腦損傷，進而抑制了caspase-3的陽性表達。事實上，大鼠在發(fā)生IR損傷之后，NBP可有效抑制其梗死灶附近缺血半暗帶區(qū)域內神經元中caspase-3的表達，進而阻止神經元發(fā)生凋亡，獲得保護神經結構和功能的效果；與Nong等〔11〕的報道相似。

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6 趙秀芹,毛文靜,李世英,等.丁苯酞對局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經細胞凋亡、SIRT1及PGC-1α表達的影響〔J〕.中國動脈硬化雜志,2016;24(8):774-80.

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10 Burgess JT,Bolderson E,Adams MN,etal.Activation and cleavage of SASH1 by caspase-3 mediates an apoptotic response〔J〕.Cell Death Dis,2016;7(11):e2469.

11 Nong K,Wang W,Niu X,etal.Hepatoprotective effect of exosomes from human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stromal cells against hepatic ischemia-reperfusion injury in rats〔J〕.Cytotherapy,2016;18(12):1548-59.

〔2016-12-28修回〕

(編輯 袁左鳴)

周盛年(1958-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事神經內科、腦血管病的研究。

庫亞萍(1983-)，女，主治醫(yī)師，主要從事神經病學、腦血管病研究。

R743

A

1005-9202(2017)05-1087-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.021

1 臨沂市人民醫(yī)院神經內科