陳寧 陳晨 李治國 曹鳳宏△

(1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科；2華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)中心實驗室,河北 唐山 063000 )

鐵蛋白輕鏈在前列腺癌中的表達及意義

陳寧1陳晨1李治國2曹鳳宏1△

(1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科；2華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)中心實驗室,河北 唐山 063000 )

目的 研究FLC在前列腺癌與前列腺增生中的表達及臨床意義。方法 采用免疫組織化學(xué)方法，對前列腺癌和前列腺增生患者病理切片進行組化檢測；采用蛋白質(zhì)印跡法對收集的前列腺癌和前列腺增生患者術(shù)后標(biāo)本進行蛋白定量。結(jié)果 FLC蛋白在前列腺癌和前列腺增生中過表達率分別是63.3%和20%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；FLC蛋白在年齡、術(shù)前PSA、前列腺體積、Gleason評分、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各分組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在遠處轉(zhuǎn)移各分組中FLC蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。前列腺癌組與前列腺增生組FLC蛋白表達水平分別為(1.52±0.27)和(0.41±0.21)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 FLC蛋白在前列腺癌中高表達，可以作為前列腺癌新的診斷手段；FLC蛋白在前列腺癌的發(fā)展過程中起重要作用。

鐵蛋白輕鏈； 前列腺癌； 免疫組化； 蛋白質(zhì)印跡法

前列腺癌與前列腺增生之間存在著大量差異蛋白，課題組挖掘出研究較少或未曾研究的差異蛋白，鐵蛋白輕鏈蛋白(ferritin light chain, FLC)就是其中之一。我們收集前列腺癌與前列腺增生患者病理切片及術(shù)后標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)及蛋白質(zhì)印跡法(Westen blot)檢測前列腺癌組和前列腺增生組中FLC蛋白表達情況。

1 資料和方法

1.1 一般資料 從華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院收集2007年1月至2014年10月前列腺癌患者及2013年1月至2014年10月前列腺增生患者臨床資料，根據(jù)隨機數(shù)字表法抽取前列腺癌患者和前列腺增生各30例，最后從華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院病理科獲得30例前列腺癌和30例前列腺增生患者病理切片。前列腺癌患者年齡51～88歲，平均(73.10±8.47)歲，血清PSA水平0.89～102.10ng/mL，平均(50.99±37.02)ng/mL；前列腺體積26.20～142.30cm3，平均(58.22±29.13)cm3?；颊咝g(shù)前均未經(jīng)抗雄激素及放療處理，行手術(shù)治療，術(shù)后病理報告均為：前列腺腺癌。臨床分期和病理分期采用2002年AJCC的TNM分期系統(tǒng)。前列腺增生患者年齡55～90歲，平均(72.10±8.98)歲；血清PSA水平0.36～29.86ng/mL，平均(5.38±7.17)ng/mL；前列腺體積23.16～154.77cm3，平均(67.68±29.28)cm3。行經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)治療，術(shù)后病理報告均為：良性前列腺增生。主要試劑為FLC山羊多克隆抗體購自英國Abcam公司，Polink-2 plus?免疫組化檢測試劑購自美國GBI公司，內(nèi)參基因β-actin購自美國AmeriBiopharma公司；二甲苯、梯度酒精、檸檬酸修復(fù)液，1×電泳緩沖液、半干轉(zhuǎn)液、TBST等實驗試劑由華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)中心實驗室提供。

1.2 方法 (1)免疫組化實驗步驟：恒溫烤箱中烤片，二甲苯及梯度酒精脫蠟、脫水，3%過氧化氫抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，檸檬酸修復(fù)液高壓修復(fù)抗原，滴加一抗FLC(1∶250)4 ℃過夜；第2天，PBS沖洗3次，滴加聚合物輔助劑(試劑1)，37 ℃恒溫箱中孵育25 min，PBS沖洗3次，滴加PV-9003(試劑2)，37 ℃恒溫箱中孵育25 min，PBS沖洗3次,顯微鏡下DAB顯色，蘇木素復(fù)染，分化液、清水中返藍，經(jīng)梯度酒精和二甲苯脫水、透明及樹脂封片完成免疫組化染色操作。免疫組化評分為染色程度：根據(jù)陽性細胞的百分比分級從0～3，0分為無；1分為1～30%；2分為31%～60%；3分為>60%。染色強度：分級從0～3，0分為無色、1分淡黃色、2分棕黃色、3分棕褐色。用兩者評分相乘得最終評分，0～3分認為是低表達(-)，>3分認為是過表達(+)。用PBS代替一抗作為陰性對照。由病理科醫(yī)生在雙盲條件下完成。(2)提取組織蛋白及Western blot檢測FLC蛋白表達量：往研體中加入液氮，放入組織標(biāo)本，充分研磨組織，加入RIPA裂解液，混均，10 000轉(zhuǎn)、4 ℃條件下，離心30 min，取上清液，得到組織蛋白。Western blot試驗步驟：用生物光譜儀測定蛋白濃度，蛋白上樣量為15 μg，用12%SDS-PAGE凝膠跑膠，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉，加入山羊抗人一抗FLC(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入兔抗山羊二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯色，條帶掃描拍照后用Quantity One軟件進行灰度值分析。重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，前列腺癌組和前列腺增生組表達率比較用卡方檢驗，根據(jù)年齡、前列腺體積、術(shù)前PSA水平、Gleason評分、臨床分期等水平不同，將前列腺癌組分層，采用Fisher確切概率法，計量資料使用兩獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FLC在前列腺癌與前列腺增生組織中的表達情況 FLC蛋白染色主要位于細胞漿和細胞膜。在前列腺癌中，F(xiàn)LC的過表達率為63.3%(19/30)；在前列腺增生中，F(xiàn)LC的過表達率為20%(6/30)，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、圖2。

圖1 FLC蛋白在前列腺癌組織中的表達情況(×200)

圖2 FLC蛋白在前列腺增生組織中的表達情況(×200)

2.2 FLC蛋白與前列腺癌主要臨床指標(biāo)的關(guān)系 在前列腺癌患者年齡分組、前列腺體積分組、術(shù)前PSA分組、Gleason評分分組、臨床分期分組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在遠處轉(zhuǎn)移分組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 FLC蛋白表達情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 Western blot檢測FLC蛋白表達情況 Western blot檢測前列腺癌組和前列腺增生組FLC蛋白表達情況,可見前列腺癌組(1.52±0.27)和前列腺增生組(0.41±0.21)相比，兩組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。見圖3。

圖3 前列腺癌(PCa)組和前列腺增生(BPH)組蛋白表達情況

3 討 論

筆者課題組通過前期準(zhǔn)備工作發(fā)現(xiàn)在前列腺癌與前列腺增生之間存在一些差異蛋白，篩選出其中研究較少或未曾研究的差異蛋白。由于蛋白組學(xué)和基因組學(xué)其本身的缺點及限制性，需要采用實驗手段進行深入研究及驗證。

目前發(fā)現(xiàn)鐵蛋白水平的升高與惡性腫瘤等疾病密切相關(guān)，并且人們已經(jīng)進行了相關(guān)實驗研究[1]。在常染色體顯性遺傳病遺傳性高鐵蛋白血癥—白內(nèi)障綜合征中發(fā)現(xiàn)鐵蛋白含量增加并對鐵蛋白的作用機制進行了探討[2]。在關(guān)于黑色素瘤研究的文獻中報道了鐵蛋白的表達水平在黑色素瘤中是明顯升高的，鐵蛋白水平的高低與黑色素瘤的惡性程度密切相關(guān)，并在黑色素瘤的發(fā)展過程中起重要作用[3]。經(jīng)過近年來的研究發(fā)現(xiàn)，鐵蛋白重鏈與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，作為與重鏈結(jié)構(gòu)類似的鐵蛋白輕鏈?zhǔn)欠褚矃⑴c腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，引起了人們的興趣，并進行了一些相關(guān)實驗研究與文獻報道。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在高級別骨肉瘤中，腫瘤的惡性程度越高，F(xiàn)LC蛋白的表達量越高，則預(yù)后較差[4]。已知在人類黑色素瘤中FLC蛋白水平是升高的，發(fā)現(xiàn)如果使FLC蛋白表達含量降低，則黑色素腫瘤患者的病情得到緩解，生存期延長[5]。同時有關(guān)文獻報道了FLC蛋白的含量在甲狀腺癌中是升高的，且FLC蛋白在卵巢癌中的表達也是升高的，可作為診斷卵巢癌的生物標(biāo)志物[6-7]。目前對于FLC蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中作用的研究較多，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，乳腺癌組患者的FLC蛋白表達量升高[8]。隨著乳腺癌惡性程度的逐漸增加，鐵蛋白重鏈和鐵蛋白輕鏈的含量也逐漸增加，鐵蛋白含量的改變可以影響乳腺癌的發(fā)展過程[9]。總之，F(xiàn)LC蛋白水平在乳腺癌中明顯升高，并進一步研究了FLC蛋白在乳腺癌中的細胞定位及在乳腺癌發(fā)生發(fā)展的作用，推論出FLC蛋白對乳腺癌預(yù)后判斷有一定指導(dǎo)價值[10]。并且已有研究發(fā)現(xiàn)可以通過FLC蛋白對乳腺癌進行診斷及預(yù)后進行判定，為乳腺癌的治療提供了一個新的分子靶向，對于提高乳腺癌患者的生存期及對有效緩解病情的發(fā)展有重要意義[11]。筆者課題組為了探討FLC蛋白與前列腺癌之間的關(guān)系，采用免疫組織化學(xué)及Western blot實驗方法，發(fā)現(xiàn)FLC蛋白在前列腺癌組中表達量升高。這些初步研究結(jié)果為以后將要進行的細胞水平實驗奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，F(xiàn)LC蛋白在前列腺癌中表達量增加，對前列腺癌的發(fā)展起重要作用。檢測FLC蛋白對鑒別前列腺癌與前列腺增生有一定的幫助，并且能夠?qū)η傲邢侔┑膼盒猿潭冗M行初步判斷，可以作為已有前列腺癌診斷手段的有益補充。

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Expression and significance of Ferritin Light Chain in prostate cancer

ChenNing1,ChenChen1,LiZhiguo2,CaoFenghong1.

1DepartmentofUrology,theAffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,Hebei,China. 2.CentralLaboratoryofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,Hebei,China.

Objective To study the expression and clinical significance of FTL in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia. Methods Immunohistochemical method was used to detect the pathological changes of the patients with prostate cancer and benign prostatic hyperplasia; protein quantification was performed on specimens collected from patients with prostate cancer and benign prostatic hyperplasia by Western blot. Results The expression rates of FTL protein in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia were 63.3% and 20%, respectively, and there were statistical significantly differences(P<0.05). But there were no statistical significantly differences of the FTL protein in the different groups of age, PSA, prostate volume, Gleason score, clinical stage and lymph node metastasis(P>0.05). There were statistical significantly differences of the expression level of FTL protein in the groups of distant metastases(P<0.05). The expression level of FTL protein in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia were (1.52±0.27) and (0.41±0.21), respectively, and there were statistical significantly differences(P<0.05).Conclusion FTL protein is highly expressed in prostate cancer, which can be used as a new diagnostic tool for prostate cancer. FTL protein plays an important role in the development of prostate cancer.

Ferritin Light Chain； Prostate cancer； Hyperplasia of prostate Immunohistochemistry； Western blot

R691.9

A

1000-744X(2016)06-0569-03

2016-03-25)

△通信作者，E-mail：cfh@163.com