周茉 陳建麗 徐艷霞 陳敏

(貴州省婦幼保健院/貴陽市兒童醫(yī)院兒童重癥醫(yī)學(xué)科，貴州 貴陽 550003)

PICU重癥肺炎患兒機(jī)械通氣后肺泡灌洗液NF-κB表達(dá)及炎性因子水平變化的研究

周茉 陳建麗△徐艷霞 陳敏

(貴州省婦幼保健院/貴陽市兒童醫(yī)院兒童重癥醫(yī)學(xué)科，貴州 貴陽 550003)

目的 觀察PICU重癥肺炎患兒機(jī)械通氣后支氣管肺泡灌洗液(BALF)中核因子-κB (NF-κB)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP-2)的表達(dá)及炎性因子水平的變化。方法 將60例患兒分為好轉(zhuǎn)和惡化兩組，采用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA法)檢測肺泡灌洗液中TNF-α水平和人巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(MIP-2)因子水平；用NF-κB免疫組化試劑盒測定NF-κB的表達(dá)情況。同時(shí)于機(jī)械通氣第2、 6天及拔管后第2天記錄呼吸力學(xué)指標(biāo)，行X線檢查，記錄生命體征、血?dú)夥治?、生命體征及胸片等綜合分析。結(jié)果 好轉(zhuǎn)組患兒BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2的表達(dá)在機(jī)械通氣后第6天及撤機(jī)后第2天明顯下降(P<0.01)，肺組織損傷情況明顯改善；反之，惡化組相關(guān)數(shù)據(jù)呈明顯上升趨勢(P<0.01)。機(jī)械通氣后BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2炎性細(xì)胞因子的表達(dá)與由機(jī)械通氣所致的肺生物傷呈正相關(guān)性。結(jié)論 炎癥反應(yīng)為呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷的主要發(fā)病機(jī)制，NF-κB、TNF-α、MIP-2的表達(dá)與VILI的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有密切關(guān)系。監(jiān)測上述細(xì)胞因子水平的變化，有助于改善預(yù)后、減輕機(jī)械通氣所致的肺生物傷。

PICU； 重癥肺炎； 肺泡灌洗液； 細(xì)胞因子

由機(jī)械性通氣引起的肺組織損傷(ventilator-inducedlung injury，VILI)主要的病理學(xué)特征為高通透性的肺水腫、中性粒細(xì)胞的聚集活化、肺泡出血及肺泡隔明顯增厚[1]。近年來，關(guān)于機(jī)械通氣造成的生物傷激活了炎癥細(xì)胞，并釋放了各類細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)，從而引發(fā)肺損傷的相關(guān)研究有了迅速發(fā)展[2]。就目前已發(fā)現(xiàn)的，參與肺損傷的炎癥細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)就多達(dá)十幾種，其中研究得最多的炎癥細(xì)胞分別是巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，所涉及的細(xì)胞因子主要為TNF-α、IL-1β和IL-8等。這些炎癥細(xì)胞與細(xì)胞因子之間相互激活、相互作用，從而構(gòu)成了一個(gè)非常龐大且復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，不僅可引起肺損傷，且可通過血液循環(huán)釋放到全身，從而引起多器官功能發(fā)生障礙(MODS)[3-4]。本研究通過持續(xù)對患兒BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2的表達(dá)及炎性因子水平的變化進(jìn)行檢測，探討它們能否作為評估肺生物傷發(fā)生、發(fā)展的量化指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 資料

選擇2013年12月至2014年12月在我院PICU住院并進(jìn)行機(jī)械通氣且撤機(jī)1周后存活的重癥肺炎患兒60例，女性36例，男性24例；年齡0.5～13歲，平均(5±4.7)歲。60例患兒均符合兒科重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。所有對象在納入前其父母或監(jiān)護(hù)人均填寫知情同意書并獲得患兒同意。

1.2 方法

根據(jù)臨床表現(xiàn)、呼吸力學(xué)指標(biāo)血?dú)夥治?、生命體征及胸片等綜合分析，將60例患兒分為好轉(zhuǎn)及惡化兩組，每組30例。于應(yīng)用機(jī)械通氣的第2、6天及撤機(jī)后第2天對其BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2水平分別進(jìn)行檢測和濃度對比，同時(shí)記錄潮氣量(VT)、每分通氣量(MV)、動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性(Crs)、呼氣阻力(R)、呼吸做功(WoB)等呼吸力學(xué)指標(biāo)；行影像學(xué)檢查；記錄體溫(T)、心率(HR)、呼吸(R)、經(jīng)皮動(dòng)脈氧飽和度(SPO2)、血壓(BP)等生命體征；血?dú)夥治觯簞?dòng)脈二氧化碳(PaCO2)、動(dòng)脈氧分壓(PaO2)；并計(jì)算氧合指數(shù)。重癥肺炎治療按第7版《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》有關(guān)診療指南進(jìn)行。

1.3 BALF標(biāo)本采集和標(biāo)本制備

患兒在充分鎮(zhèn)靜下經(jīng)氣管插管行支氣管肺泡灌洗術(shù)，灌洗時(shí)將37℃生理鹽水1 mL/(kg·次)注入氣管插管，復(fù)蘇囊加壓給氧，充分拍背后將灌洗液回抽，共灌洗2～3次，回收率>40%。取患兒雙側(cè)肺BALF，超低溫冷凍后送重慶金麥生物技術(shù)有限公司進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)分別檢測第2、6天及撤機(jī)后第2天的NF-κB、TNF-α、MIP-2水平變化。TNF-alpha、MIP-2試劑盒均代購于eBioscience 公司，NF-kB試劑盒代購于Active motif 公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

兩組患兒插管后第2天各細(xì)胞因子表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05);插管后第6天好轉(zhuǎn)組細(xì)胞因子表達(dá)水平呈下降趨勢、惡化組呈上升趨勢(P<0.01)；撤機(jī)后第2天兩組各細(xì)胞因子水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且好轉(zhuǎn)組各項(xiàng)指標(biāo)隨著時(shí)間的延長，其表達(dá)水平呈遞減趨勢，反之，惡化組呈遞增趨勢。見表1。

表1 兩組患兒機(jī)械通氣第2、6 d各細(xì)胞因子表達(dá)水平的比較(n=30)

注：插管后2 d比較*P>0.05；與插管后6 d比較：△P<0.01；與撤機(jī)后6 d比較▲P<0.01。

兩組患兒插管后第2天與第6天比較，各細(xì)胞因子表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(TNF-α，P<0.05；NF-κB、TNF-α、MIP-2，P<0.01)。插管后第6天與撤機(jī)后第2天比較，兩組NF-κB、TNF-α、MIP-2水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。插管后第2天與撤機(jī)后第2天比較，兩組NF-κB、TNF-α、MIP-2差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中好轉(zhuǎn)組患兒NF-κB、TNF-α、MIP-2在機(jī)械通氣撤機(jī)后第2天較插管后第2天明顯下降(P<0.01)，三項(xiàng)指標(biāo)隨著時(shí)間的延長呈遞減趨勢；而惡化組患兒三項(xiàng)指標(biāo)同期明顯升高(P<0.01)，并隨著時(shí)間的延長呈顯著上升趨勢。見表2。

表2 兩組患兒機(jī)械通氣第2、6天各細(xì)胞因子表達(dá)水平的組內(nèi)比較

注：插管后6 d與插管后2 d比較☆P<0.05,*P<0.01；撤機(jī)后2 d與插管后6 d比較△P<0.01；撤機(jī)后2 d與撤機(jī)后2d比較▲P<0.01。

3 討 論

VILI早期表現(xiàn)為機(jī)械性損傷，隨后可演變?yōu)橐匝仔约?xì)胞、細(xì)胞因子介導(dǎo)的生物傷[6]。有研究顯示，中性粒細(xì)胞是引起VILI的主要炎癥細(xì)胞，它在肺組織中聚集活化，并釋放大量的蛋白溶解酶、氧自由基及細(xì)胞因子等物質(zhì)，當(dāng)這些物質(zhì)的釋放量超出機(jī)體的清除能力時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致肺組織的病理性損傷[7]。

機(jī)械應(yīng)力激發(fā)刺激自由基的產(chǎn)生，從而促進(jìn)P-選擇素的胞外分泌，同時(shí)通過NF-κB激活后刺激血管細(xì)胞粘附分子的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)[8]。有關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，NF-κB的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可介導(dǎo)機(jī)械通氣所致肺生物傷時(shí)許多細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的釋放[9-10]。NF-κB還可活化結(jié)合編碼細(xì)胞因子如TNF-α等基因的啟動(dòng)子或增加子的κB結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)機(jī)械性肺損傷的發(fā)生。

大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TNF-α作為一種前炎癥細(xì)胞因子，不僅能增強(qiáng)中性粒細(xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞的功能，還可以對其周圍細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，同時(shí)它也是一種十分重要的炎癥級聯(lián)反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，在VILI的發(fā)病機(jī)制中起到十分重要的作用[11-12]。此外，有關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[13]表明， MIP-2在趨化中性粒細(xì)胞的聚集活化中起主導(dǎo)作用。

VILI不僅僅包括機(jī)械性損傷，還包括由多種炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)參與的生物性損傷。機(jī)械性損傷可誘發(fā)生物性損傷，而生物性損傷反過來又可加重機(jī)械性損傷，兩者相輔相成、相互促進(jìn)。盡管呼吸機(jī)所致肺生物性損傷涉及的炎癥細(xì)胞和炎性因子很多，關(guān)系非常復(fù)雜，但它們可能通過共同的炎癥反應(yīng)通路而引起肺組織損傷。本研究結(jié)果顯示，機(jī)械通氣后BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2的表達(dá)與肺生物傷呈正相關(guān)性，具體表現(xiàn)為隨著重癥肺炎患兒病情的好轉(zhuǎn)或惡化，炎性細(xì)胞因子NF-κB、TNF-α、MIP-2的表達(dá)也分別呈顯著遞減或上升趨勢。炎癥反應(yīng)為VILI的主要發(fā)病機(jī)制，NF-κB、TNF-α、MIP-2的表達(dá)與VILI的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有密切關(guān)系。監(jiān)測對比機(jī)械通氣后BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2炎性細(xì)胞因子水平的變化，可作為判斷重癥肺炎患兒行機(jī)械通氣及藥物治療后療效及疾病轉(zhuǎn)歸的方法之一以及可在臨床上操作的一項(xiàng)量化指標(biāo)；而對上述炎性細(xì)胞因子水平呈顯著上升趨勢者，應(yīng)警惕病情有惡化的趨勢，需進(jìn)一步尋找惡化原因并及時(shí)調(diào)整治療方案，這對改善預(yù)后、減輕VILI有一定的幫助。

[1] Ricard JD，Dreyfuss D，Saumon G. Ventilator-induced lung injury[J]．EurRespir J Suppl,2003，42：2-9．

[2] Dreyfuss D，Rieard J-D，Saumon G.On the physiologic and clinical relevance of lung-borne cytokines during ventilator-induced lung injury[J]．Am J Respir Crit Care Med ,2003,167：1467-1471．

[3] Ricard JD，Dreyfuss D，Saumon G. Production of inflammatory cytokines in ventilator-induced lung injury：a reappraisal[J]．Am J Respir Crit Care Med，2001,163：1176-1180．

[4] Chiumello D，Pristine GSlutsky AS．Mechanical ventilafion affects local and systemic cytokines in all animal model of acute respiratory distress syndrome[J]．Am J Respir Crit Care Med，1999，160：109-116．

[5] 兒童醫(yī)院獲得性肺炎管理方案(2010版)[J].中華兒科雜志,2011,49(2):106-115.

[6] Wheeler K，Klingenberg C，McCallion N．et al，Volume-targeted versus pressure-limited ventilation in the neonate．Cochrane Database Syst Rev，2010，10(11)：CD003666．doi：10．1002/14651858．

[7] Choudhury S，Wilson MR,Goddard ME，et a1.Mechanisms of early pulmonary neutrophil sequestration in ventilator-induced lung injury in mice[J]．Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2004，287：902·910．

[8] Huang CS，Kawamura T，Peng X，et a1．Hydrogen inhalation redueed epithelial apoptcsis in ventilator-induced lung injury via a mechanism involving nuclear factor-kappa B activation[J]．Biochem Biophys Res Cormnun，2011，408(2)：253-258．

[9] Li LF,Ouyang B，Choukroun G,et a1．Stretch-induced IL-8 depends on c-Jun NH2-terminal and nuclear factor-KB-inducing kinases[J]．Am J Paysiol Lung Cell Mol Physiol，2003，285：464-475．

[10] Bhatmcharya S，Sen N，Yiming MT,et a1．High tidal volume ventilation induces proinflammatory signaling in rat lung endothelium[J]．Am J Respir Cell Mo1 Bio1，2003，28：218-224．

[11] 章琳,楊渭臨.沙利度胺對老年特發(fā)性肺纖維化患者BALF中IL-6、TNF-α、TGF-β1表達(dá)的影響[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版，2012,33(5):622-625.

[12] 楊俊玲,尹金植,李青山,等．實(shí)驗(yàn)性肺纖維化小鼠IL-1和TNF-α的動(dòng)態(tài)表達(dá)及其意義[J]．吉林大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版，2007，33(3):522-525．

[13] Quinn DA，Moufarrej RK，Volokhov A，et a1．Interactions of lung stretch，hyperoxia，and MIP-2 production in ventilator-induced lung injury[J]．J Appl Physiol，2002,93：517-525．

Study on the expression of NF-κB and inflammatory factor in Broncho alveolar lavage fluid after mechanical ventilation in children with severe pneumonia in PICU

ZhouMo,ChenJianli*,XuYanxia,ChenMin.

PediatricIntensiveCareUnit,GuizhouProvincialChildren'sHospital,MaternalandChildHealthCareHospitalGuiyang550003,Guizhou,China.

Objective To observe the changes of clinical index, to explore the possibility of the expression of nuclear factor-κB(NF-κB), tumor necrosis factor alpha(TNF-α), macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2) inflammatory factor genes, by observing the Broncho alveolar lavage fluid(BALF)in children with pneumonias in the PICU, as the quantitative indices of the development lung biotrauma. Methods Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to check the expressions of TNF-α and MIP-2 in BALF 2 days and 6 days after mechanical ventilation and 2 days after extubation. The expression of NF-κB protein in lung tissues was detected by immunohistochemistry for measurement. And at the same time，the parameters of respiratory mechanics, arterial blood gases and chest X-ray were monitored. In accordance with the analyses of the aforementioned data, sixty cases were divided into two groups, 30 cases in each. One was the improvement group, and the other was deterioration group. Results Compared to the improvement group 2 days after mechanical ventilation，the expressions of TNF-α, NF-κB and MIP-2 in BALF of patients in improvement group 6 days after mechanical ventilation significantly decreased (P<0.01)，and the pulmonary function significantly improved after 6 days of treatment． For patients in the deterioration group，the expressions of TNF-α, NF-κB and MIP-2 in BALF were significantly elevated (P>0.01) after 6 days of mechanical ventilation compared to 2 days later. The positive correlation between the expressions of TNF-α，NF-κB and MIP-2 in BALF of patients undergoing mechanical ventilation and the lung injury caused by mechanical ventilation. With the improvement of disease, the expressions of TNF-α, NF-κB and MIP-2 in BALF of the children with pneumonias significantly decreased. With the deterioration of disease, those expressions of inflammatory factors rose significantly.Conclusion Inflammatory response is the major pathogenesis of ventilation induced lung injury (VILI), there is close relationship between the expressions of TNF-α, NF-κB and MIP-2 and the development of VILI. And can be used to judge the curative effect and prognosis of the patients.

Pediatric intensive care (PICU)； Severe pneumonia； Broncho alveolar lavage fluid； Cell factor

貴陽市衛(wèi)生局科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目及高層次創(chuàng)新型青年衛(wèi)生人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(筑衛(wèi)科技合同字[ 2013 ]第創(chuàng)17號(hào))

R725.6

A

1000-744X(2016)08-0807-03

2016-03-09)

△通信作者，E-mail：1165438489@qq.com