劉 浩 趙 燕 張念平 張 曉 張 琳

(濟(jì)南市第三人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東 濟(jì)南 250032)

Notch細(xì)胞信號(hào)通路在神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化中的作用

劉 浩 趙 燕 張念平1張 曉 張 琳2

(濟(jì)南市第三人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東 濟(jì)南 250032)

Notch；神經(jīng)干細(xì)胞；增殖分化

Notch是相鄰細(xì)胞之間互相通訊的典型信號(hào)通路，其作用具有多樣性，在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和細(xì)胞周期等方面都發(fā)揮了重要作用。神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的增殖分化受諸多因素影響，越來(lái)越多的證據(jù)表明Notch細(xì)胞信號(hào)通路在此過(guò)程中具有重要作用。本文主要就Notch信號(hào)通路及其對(duì)NSCs增殖分化的作用進(jìn)行綜述。

1 Notch細(xì)胞信號(hào)通路的組成

Notch細(xì)胞信號(hào)通路主要由Notch受體、配體(DSL)、CSL蛋白和下游靶基因組成。典型的Notch信號(hào)通路激活大致過(guò)程為：Notch受體與配體DSL結(jié)合，釋放出的Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)進(jìn)入細(xì)胞核與CSL蛋白結(jié)合，激活下游靶基因。以上為CSL依賴(lài)性通路，此外Notch蛋白還可以通過(guò)非CSL依賴(lài)性通路發(fā)揮作用。與典型的Notch信號(hào)通路的主要區(qū)別在于，非典型Notch信號(hào)通路由非典型的配體引發(fā)，不需要Notch受體的裂解，也無(wú)需CSL參與，如Deltex依賴(lài)性通路等〔1〕。

Notch受體表達(dá)在細(xì)胞表面，主要由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3部分構(gòu)成。胞外區(qū)是結(jié)合配體的區(qū)域，由數(shù)目不定的(一般29～36個(gè))表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)序列(EGF-R)和3 個(gè)富含半胱氨酸的Lin-12-Notch重復(fù)序列(LNR)組成，其中第11、12 個(gè)EGF-R 重復(fù)序列介導(dǎo)與配體的相互作用〔2〕。在跨膜區(qū)甘氨酸-1743和纈氨酸-1744之間有一個(gè)裂解位點(diǎn)(S3位點(diǎn))。此位點(diǎn)經(jīng)相關(guān)蛋白酶的水解作用，Notch在S3位點(diǎn)發(fā)生斷裂，生成胞內(nèi)區(qū)NICD和一個(gè)短的跨膜片段。Notch受體胞內(nèi)區(qū)包含1個(gè)重組信號(hào)結(jié)合蛋白-Jk相關(guān)分子RAM(RBP)-J結(jié)構(gòu)域、6～7個(gè)錨蛋白重復(fù)序列(ANK)、1 個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性的PEST 結(jié)構(gòu)域〔富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)〕。另外Notch 1～3受體還含有2 個(gè)核定位信號(hào)(NLS)，而Notch4受體只有1個(gè)NLS。核定位信號(hào)能使Notch受體胞內(nèi)域到達(dá)細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而胞內(nèi)域上的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(TAD)啟動(dòng)下游事件，值得指出的是Notch3、Notch4不含有TAD結(jié)構(gòu)域〔3〕。胞內(nèi)區(qū)可將Notch 信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，其中RAM結(jié)構(gòu)域是與CSL結(jié)合的區(qū)域，PEST結(jié)構(gòu)域與Notch受體的降解有關(guān)。

果蠅中只有一個(gè)Notch 受體，哺乳動(dòng)物中有4 個(gè)Notch 同源受體：Notch1、2、3和4。Notch蛋白合成后發(fā)揮作用前需要經(jīng)過(guò)3次切割。第一次是在高爾基體內(nèi)被Furin轉(zhuǎn)化酶裂解為2個(gè)片段：Nothc蛋白胞外區(qū)(ECN)和Notch蛋白跨膜區(qū)(NTM)，兩者隨后通過(guò)鈣依賴(lài)性非共價(jià)鍵結(jié)合形成異二聚體，被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上。當(dāng)配體與Notch蛋白胞外域結(jié)合后，Notch蛋白又發(fā)生兩次蛋白水解，首先是被腫瘤壞死因子-α-轉(zhuǎn)化酶(TACE)酶解，然后γ-促分泌酶催化第二次分裂，最后這一過(guò)程需要早老蛋白(PS)參與。經(jīng)歷3次酶切的Notch蛋白釋放出NICD進(jìn)入胞質(zhì)，并被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，在轉(zhuǎn)錄輔助因子CoA及其他因子的參與下與CSL結(jié)合，繼而調(diào)節(jié)其下游的靶基因〔4〕。DSL也是一種跨膜蛋白，包含細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域,其特點(diǎn)是胞外區(qū)包含數(shù)量不等的EGF-R重復(fù)序列和DSL結(jié)構(gòu)域(富含半胱氨酸，是配體與Notch蛋白相互作用的位點(diǎn))。Notch配體表達(dá)于Notch受體所在細(xì)胞的鄰近細(xì)胞上，能激活鄰近細(xì)胞表面的Notch受體，進(jìn)而調(diào)節(jié)附近細(xì)胞的增殖分化。在果蠅體內(nèi)Notch配體有兩種：Delta和Serrate配體。線蟲(chóng)體內(nèi)的Notch配體為：Lag-2配體。故Notch配體又稱(chēng)DSL蛋白〔5〕。哺乳動(dòng)物有5種Notch同源配體：其中與Delta 同源的稱(chēng)為Delta 樣配體(包括Delta-like-1、Delta-like-3、Delta-like-4，即DⅡ-1、DⅡ-3、DⅡ-4)；與Serrate 同源的稱(chēng)為Jagged-1 和Jagged-2配體(JAG-1、JAG-2)〔6,7〕。

CSL是一組DNA結(jié)合蛋白，在哺乳動(dòng)物中叫作CBF1(又叫RBP-Jκ)，在果蠅中叫作Su(H)，在線蟲(chóng)中叫作Lag-1，取首字母縮寫(xiě)為CSL〔8〕。此蛋白在Notch信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用，它識(shí)別并結(jié)合Notch誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子上特定的DNA序列(GTGGGAA)。以哺乳動(dòng)物為例，在沒(méi)有NICD的情況下，RBP-Jκ通過(guò)募集阻遏復(fù)合物蛋白(SHARP)形成共抑制復(fù)合物抑制Notch下游基因的轉(zhuǎn)錄。SHARP由輔抑因子甲維酸(SMRT)蛋白和組蛋白去乙酰相關(guān)阻遏蛋白(HDAC)-1組蛋白脫乙酰酶組成，它作為一個(gè)作用平臺(tái)招募C-末端結(jié)合蛋白-相互作用蛋白(CtIP)和其他輔阻遏物及組蛋白修飾酶，與RBP-Jκ共同阻止下游基因的表達(dá)。當(dāng)有NICD存在的情況下，NICD和RBP-Jκ結(jié)合，并招募輔激活物如主導(dǎo)控制樣蛋白(MAML)-1和其他一些染色質(zhì)修飾轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而啟動(dòng)Notch靶基因的轉(zhuǎn)錄〔9〕。CSL蛋白是Notch信號(hào)通路中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，此為經(jīng)典的Notch信號(hào)通路又稱(chēng)為CSL依賴(lài)途徑。

Notch信號(hào)的靶基因主要是堿性螺旋-環(huán)-螺旋基因(bHLH)，如哺乳動(dòng)物中的發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子(HES)、果蠅中的E(sp1)，非洲爪蟾中的Xhey-1。bHLH 基因包括促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生基因(促進(jìn)型)和抑制神經(jīng)發(fā)生基因(抑制型)兩類(lèi)。促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生基因包括神經(jīng)分化發(fā)育相關(guān)基因Mash-1、Math、Ngn1/2、Neuro D。抑制神經(jīng)發(fā)生基因有HES-1、HES-3 和HES-5及HES相關(guān)蛋白基因(HERP)〔10〕。此外有文章指出Notch信號(hào)還可作用于周期依賴(lài)性蛋白激酶、原癌基因c-myc及細(xì)胞周期蛋白等。上述這些基因中，以HES和Hey作為Notch信號(hào)通路靶基因的觀點(diǎn)最為人們廣泛接受。研究〔11〕表明膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、腦脂質(zhì)結(jié)合蛋白(BLBP)、SOX2及p53等都是Notch信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)。然而這些研究是基于體外基因水平及細(xì)胞層面上的探討，至于生物體內(nèi)受NICD/RBP-Jκ復(fù)合物調(diào)控的全部的下游靶基因，仍然是一個(gè)未知數(shù)〔11〕。

2 Notch信號(hào)通路影響NSCs的增殖分化

NSCs是一類(lèi)具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞,給予一定的誘導(dǎo)條件,能分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞。很多研究〔12～19〕表明Notch信號(hào)通路調(diào)控NSCs的增殖分化。Notch受體和DSL表達(dá)于相鄰的細(xì)胞膜上,當(dāng)某一細(xì)胞DSL表達(dá)升高后，就會(huì)與鄰近細(xì)胞表面的Notch受體結(jié)合，進(jìn)而激活Notch細(xì)胞信號(hào)通路,從而阻止鄰近的細(xì)胞向同一方向分化，這就是所謂的“旁側(cè)抑制”作用。

在發(fā)育過(guò)程中，Notch信號(hào)通路決定了細(xì)胞的命運(yùn)，同時(shí)在維持NSCs的特性方面也起重要作用。Notch1、Presenilins 和RBP是Notch信號(hào)通路的關(guān)鍵組成部分，在Notch1-/-、Presenilins-/-或RBP-Jκ-/- 的胚胎老鼠腦內(nèi)，NSCs被完全耗盡。Notch下游靶基因Hes1、Hes5的失活，會(huì)導(dǎo)致腦發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)元過(guò)早的分化。以Presenilins缺陷的老鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路能維持NSCs特性的穩(wěn)定，此作用與老鼠的鼠齡、NSCs在腦內(nèi)的位置無(wú)關(guān)〔12〕。研究〔13〕發(fā)現(xiàn)HES家族的DPN蛋白是果蠅NSCs維持自我更新能力的必要充分條件。DPN蛋白的減少會(huì)導(dǎo)致NSCs過(guò)早減少，這一過(guò)程可能是由同源異形盒蛋白Pros介導(dǎo)。相反，過(guò)表達(dá)DPN蛋白能使細(xì)胞提高并保持自我更新能力。另外，過(guò)表達(dá)Notch引起果蠅Ⅱ型NSCs和神經(jīng)祖細(xì)胞增殖，而DPN蛋白的減少并沒(méi)有抑制其增殖。這提示DPN蛋白和Notch在調(diào)控Ⅱ型NSCs的增殖中的作用相互獨(dú)立〔13〕。

目前普遍的認(rèn)識(shí)是激活Notch信號(hào)通路會(huì)抑制NSCs向神經(jīng)元的分化，相反當(dāng)阻斷Notch細(xì)胞信號(hào)通路后，可促進(jìn)向神經(jīng)元分化。Notch信號(hào)通路對(duì)NSCs向膠質(zhì)細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)卻有截然不同的效果，即Notch信號(hào)通路的激活促進(jìn)NSCs向星型膠質(zhì)細(xì)胞的分化,抑制NSCs向少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化。在神經(jīng)發(fā)生過(guò)程中，新生的神經(jīng)元分泌Notch配體(如Jagged 1、Delta-like 1)來(lái)激活其他NSCs的Notch信號(hào)通路。此時(shí)，Notch通路的激活是星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的充分必要條件。NSCs表達(dá)的NICD會(huì)導(dǎo)致GFAP啟動(dòng)子的脫甲基化，使GFAP表達(dá)。Notch是通過(guò)其下游靶基因NF1A對(duì)GFAP啟動(dòng)子起作用的，NF1A是一種轉(zhuǎn)錄因子，它誘導(dǎo)GFAP啟動(dòng)子上DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)1的釋放，從而使星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)。由于Notch通路能有效地誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化，它的作用也被嚴(yán)格調(diào)控著。NF1A可以通過(guò)抑制Hes1來(lái)限制Notch通路發(fā)揮作用，這個(gè)負(fù)反饋回路能防止過(guò)多地產(chǎn)生星形膠質(zhì)細(xì)胞〔14〕。

不同的bHLH基因具有不同的功能，并按時(shí)空順序表達(dá)于細(xì)胞分化的不同階段。當(dāng)促進(jìn)型bHLH 基因表達(dá)上調(diào)時(shí)，不僅可以促使神經(jīng)元的生成，而且可以誘導(dǎo)Notch 配體的表達(dá)，這些配體可以活化鄰近細(xì)胞的Notch 信號(hào)通路，上調(diào)其HES-1、HES-3 和HES-5的表達(dá)，從而保持鄰近細(xì)胞的未分化狀態(tài)，維持NSCs的穩(wěn)定和增殖〔15〕。抑制型bHLH 基因表達(dá)時(shí)，部分NSCs的分化被抑制，在晚些時(shí)候分化為膠質(zhì)細(xì)胞，從而保持神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞合適的數(shù)目和比例。當(dāng)抑制型bHLH基因缺失時(shí)，NSCs過(guò)早地分化為神經(jīng)元，導(dǎo)致NSCs消耗殆盡，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少〔16〕。此外，抑制型bHLH 基因可對(duì)促進(jìn)型bHLH 基因進(jìn)行抑制，如Hes1和Hes5的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),能對(duì)Mash-1、Math、Ngn1等進(jìn)行抑制，阻止NSCs的分化〔17〕。抑制型bHLH基因和促進(jìn)型bHLH基因相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)節(jié)NSCs的分化，這能維持正常的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目。

γ-促分泌酶是Notch信號(hào)通路中的一個(gè)重要組成部分。N-〔N-(3，5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨?！?2-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)是γ-促分泌酶的抑制劑，可以阻止NICD的釋放，從而使Notch信號(hào)不能發(fā)揮正常的作用。Borghese等〔18〕認(rèn)為Notch能維持胚胎干細(xì)胞來(lái)源的NSCs的自我更新能力，抑制細(xì)胞分化，而DAPT介導(dǎo)的Notch信號(hào)通路抑制，可以延遲DNA合成前期(G1)向DNA合成期(S)的過(guò)渡，并使胚胎干細(xì)胞來(lái)源的NSCs分化。最近的研究也發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)經(jīng)DAPT處理后能加速向NSCs分化。于iPSCs培養(yǎng)的第22天，對(duì)巢蛋白、β-Ⅲ微管蛋白、GFAP等各種細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析和免疫熒光分析均證實(shí)這些細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)上調(diào)。實(shí)驗(yàn)表明阻斷Notch信號(hào)通路，可促使iPSCs向NSCs分化，最終形成星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元。研究還指出，在iPSCs向NSCs分化過(guò)程中，Notch信號(hào)通路上的相關(guān)分子表達(dá)降低，而有些miRNA表達(dá)卻增加了。因此，在iPSCs分化過(guò)程中，Notch信號(hào)通路可能是在miRNA的調(diào)控下發(fā)揮作用〔19〕。

另外，Notch信號(hào)通路還能與Numb蛋白一起，共同對(duì)NSCs的分裂起調(diào)控作用。Numb蛋白能決定多細(xì)胞生物細(xì)胞的不對(duì)稱(chēng)分裂，它可能通過(guò)作用于Notch的胞內(nèi)域來(lái)發(fā)揮拮抗Notch信號(hào)通路的作用。Notch受到Numb蛋白的拮抗，能使NSCs向神經(jīng)元分化。當(dāng)無(wú)Numb蛋白對(duì)Notch拮抗，則使干細(xì)胞處于未分化的狀態(tài)。Numb蛋白介導(dǎo)不對(duì)稱(chēng)分裂，因此當(dāng)Numb蛋白功能缺失時(shí)，NSCs將發(fā)生對(duì)稱(chēng)分裂，即分裂為兩個(gè)相同的NSCs，在分裂的過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)元〔20〕。

綜上，NSCs在體外可以誘導(dǎo)分化為不同類(lèi)型的細(xì)胞，如多巴胺能神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元等，可以通過(guò)移植分化成熟的神經(jīng)細(xì)胞治療各類(lèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。NSCs的分化過(guò)程非常復(fù)雜，受多種誘導(dǎo)因子和細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控。NSCs定向分化的機(jī)制仍然不清楚，不能準(zhǔn)確控制每個(gè)NSCs按預(yù)想的途徑分化，這在一定程度上限制了NSCs的應(yīng)用，需要在NSCs分化機(jī)制上進(jìn)行深入的研究。

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〔2015-12-29修回〕

(編輯 苑云杰/王一涵)

張念平(1984-)，男，博士，主要從事老年病研究。

劉 浩(1974-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事重癥醫(yī)學(xué)臨床與基礎(chǔ)研究。

R34

A

1005-9202(2017)01-0247-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.107

1 廣州醫(yī)科大學(xué) 2 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院