王 丹，楊 峰，李新圃，羅金印，張 哲，劉龍海，張亞茹，張莉莉，李宏勝（.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050；．蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，蘭州 730000）

綜述與專論

PCR診斷技術(shù)用于奶牛乳房炎病原菌快速檢測的研究進(jìn)展

王 丹1，楊 峰1，李新圃1，羅金印1，張 哲1，劉龍海1，張亞茹1，張莉莉2，李宏勝1
（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050；2．蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，蘭州 730000）

奶牛乳房炎是一種嚴(yán)重影響奶牛業(yè)發(fā)展的常見多發(fā)病，不僅給乳品業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且還影響乳品質(zhì)量，危及人類健康。目前，對于奶牛乳房炎的治療大部分奶牛場基本都是在不明確病原菌的情況下濫用抗生素，造成病原菌耐藥性增加，治療效果下降。為了有效治療奶牛乳房炎，對奶牛乳房炎病原菌的早期快速診斷至關(guān)重要。由于傳統(tǒng)的乳房炎病原菌的檢測方法存在操作繁瑣、耗時(shí)長、靈敏度低及無法檢測抗生素乳樣中病原菌等缺陷，因此，臨床上急需一種快速、靈敏、簡便的檢測方法。作者對目前用于奶牛乳房炎病原菌診斷的普通PCR法、多重PCR法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、巢氏PCR診斷法以及PCR檢測試劑盒等進(jìn)行了綜述，并分析了這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)，同時(shí)對未來奶牛乳房炎病原菌診斷的研究方向和前景進(jìn)行了展望，以期為進(jìn)一步開發(fā)快速、特異、敏感的奶牛乳房炎病原菌診斷技術(shù)提供理論參考。

PCR；奶牛；乳房炎；病原菌

奶牛乳房炎是影響世界奶牛業(yè)發(fā)展，給乳品業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的一種常見多發(fā)病。是一種由病原微生物感染而引起乳房組織及乳頭炎癥的一種疾?。?］。目前，對于奶牛乳房炎病原菌的檢測，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)及生化鑒定仍然是使用最廣的一種方法，但由于該方法操作繁瑣，耗時(shí)長，對操作者的要求高，不能滿足早診斷、早治療的目標(biāo)，而且經(jīng)抗生素治療后的乳樣，容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果［2］。因此，為了提高奶牛乳房炎的治療效果，急需一種快速、靈敏、簡便的檢測方法。當(dāng)前，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，PCR技術(shù)在檢測病原菌方面得到廣泛應(yīng)用，并展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景［3］。與傳統(tǒng)的微生物法相比，PCR診斷法具有樣品不用培養(yǎng)、檢測時(shí)間短、靈敏度高、費(fèi)用低、檢測病原菌范圍廣、不受抗生素治療影響等優(yōu)點(diǎn)［4］。本文對目前用于奶牛乳房炎主要病原菌的普通PCR診斷法、多重PCR診斷法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR診斷法和巢氏PCR診斷法等進(jìn)行了綜述，以期為進(jìn)一步開發(fā)快速、特異、敏感的奶牛乳房炎病原菌PCR診斷技術(shù)提供一定的幫助。

1 普通PCR診斷法

自從1983年Mullis等發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）之后，該技術(shù)在檢測致病菌方面得以廣泛應(yīng)用，尤其是在診斷奶牛乳房炎的過程中展現(xiàn)出其快速、靈敏、特異的優(yōu)勢，并逐步建立起了相對成熟的PCR乳房炎分子診斷方法。在實(shí)際應(yīng)用中，國內(nèi)外研究者也取得了諸多成效。Forsman等［5］利用16S～23S rRNA基因分別建立了檢測葡萄球菌和鏈球菌的PCR診斷體系，發(fā)現(xiàn)16S～23S rRNA間隔區(qū)具有較高的保守性，用這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物具有較高的特異性［6］。Riyaz-UI-Hassan等［7］利用PCR診斷法快速診斷傷寒沙門氏菌引起的乳房炎。Higuchi等［8］用PCR法成功診斷了牛支原體。布日額等［9］運(yùn)用牛表面免疫相關(guān)蛋白基因（SIP），建立了快速診斷牛乳中的無乳鏈球菌。賀生中等［10］則以無乳鏈球菌特異性STRA-AgI-23-ID基因序列為模板，設(shè)計(jì)了一對引物，快速檢測奶牛乳房炎樣品中的無乳鏈球菌。普通PCR檢測與傳統(tǒng)檢測相比雖然有一定的優(yōu)勢，但是普通PCR檢測是一種引物擴(kuò)增一個(gè)特定的核酸序列，只能檢測一種病原菌，但實(shí)際中，引發(fā)奶牛乳房炎的病原菌的種類繁多，普通PCR法則不能滿足同時(shí)檢測多個(gè)病原菌的要求。

2 多重PCR診斷法

多重PCR檢測法克服了普通PCR引物單一的缺陷，是在其基礎(chǔ)上改進(jìn)而來的。多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系中加入2對以上的引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過程與普通PCR相同，但能夠用于多種病原微生物的同時(shí)檢測或鑒定。2001年，Riffon［11］率先建立了一個(gè)多重PCR體系，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測引起奶牛乳房炎的4種主要病原菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌）。之后，在2002年，印度研究者Ramesh［12］建立了雙重PCR體系，能直接從乳房炎樣品中同時(shí)檢測金黃色葡萄球菌和結(jié)腸炎耶爾森桿菌，且這兩種病原菌的檢測下限分別可以達(dá)到10 cfu/mL和103cfu/mL。國內(nèi)也有許多研究者將多重PCR用于奶牛乳房炎的診斷。謝志勤等［13］和肖穎等［14］也先后用三重PCR體系實(shí)現(xiàn)了對金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌的鑒定。陳玉霞等［15］建立了同時(shí)診斷金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌的三重PCR體系，且這3種病原菌的檢測靈敏度分別為1×106、1×106和1×103cfu/mL。在2010年，高健等［16］基于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌的16S～23S rRNA基因，建立了多重PCR體系，并通過對其優(yōu)化，幾種病原菌的檢測靈敏度均達(dá)到3×102～103cfu/mL。除了對奶牛乳房炎最主要致病菌（金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、大腸桿菌）的檢測外，李棟梁等［17］分別基于16S rDNA保守序列區(qū)間設(shè)計(jì)了5對引物，建立了用于診斷產(chǎn)氣莢膜梭菌、乳酸乳球菌、變形桿菌、綠膿桿菌和腸桿菌的多重PCR體系。多重PCR的應(yīng)用使奶牛乳房炎的診斷更為快捷、簡便，是PCR臨床應(yīng)用研究中頗具吸引力的診斷技術(shù)。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR診斷法

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR迎來了飛躍式發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR診斷法（Real-time PCR）就是最顯著的體現(xiàn)。Real-time PCR利用熒光信號(hào)監(jiān)測整個(gè)PCR擴(kuò)增過程，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。相對傳統(tǒng)的PCR診斷法，Real-time PCR技術(shù)檢測的靈敏度不僅大大提升，而且還能夠明確地檢測出乳房炎樣品中含有的細(xì)菌數(shù)量，實(shí)現(xiàn)了PCR技術(shù)從定性到定量的飛躍。Graber等［18］以nuc為目的基因，應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測乳房炎源性的金黃色葡萄球菌，且檢測敏感性為1.15×103cfu/mL。瑞士研究者Rossetti等［19］通過設(shè)計(jì)雜交探針建立了Real-time PCR的診斷方法，成功檢測了牛支原體。邢建明等［20］以金黃色femB基因作為靶序列，應(yīng)用TaqMan探針技術(shù)建立了Real-time PCR方法，快速、準(zhǔn)確、特異性的定量檢測乳房炎樣品中的金黃色葡萄球菌。由于金黃色葡萄球菌femB基因是高度保守的特異性標(biāo)記基因，故該診斷法能夠準(zhǔn)確地將金黃色葡萄球菌與其同源性較高的葡萄球菌區(qū)分開。

4 巢氏PCR診斷法

巢氏PCR過程中要進(jìn)行兩輪的反應(yīng)，設(shè)計(jì)兩對引物，第1對可以擴(kuò)增一個(gè)大片段，第2對引物擴(kuò)增位于大片段中的小片段，所以稱為巢氏PCR。早在2005年賈玉萍等［21］就用巢氏PCR方法檢測無乳鏈球菌16S rRNA，檢測的靈敏度可達(dá)到1cfu/mL。史秋梅等［22］利用鏈球菌屬16S rRNA基因的保守區(qū)內(nèi)的可變區(qū)設(shè)計(jì)無乳鏈球菌特異引物，建立了奶牛乳房炎無乳鏈球菌的巢氏PCR檢測方法，檢測結(jié)果與生化鑒定結(jié)果的符合率達(dá)100%。

4 PCR檢測試劑盒

PCR法作為一項(xiàng)應(yīng)用前景很廣的檢測技術(shù)手段，集成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的試劑盒從而大批量地應(yīng)用于臨床的快速診斷成為迫切需求。目前，國內(nèi)外許多研究者以PCR檢測法為基礎(chǔ)，研發(fā)出適用于臨床快速診斷的商品化試劑盒。Zhou等［23］研發(fā)出奶牛中安氏隱孢子病原PCR檢測試劑盒，該試劑盒具有較高的特異性和靈敏性。2009年，研究者又開發(fā)了一個(gè)針對多種乳房炎病原菌的Real-time PCR診斷試劑盒，可以同時(shí)檢測出金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、乳酸球菌、糞腸球菌、克雷伯氏菌、牛棒狀桿菌等23種病原菌［24-25］。陳亞明［26］研發(fā)了一種四重PCR快速診斷試劑盒，能同時(shí)檢測出金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌及蠟樣芽胞桿菌。王旭榮等［27］研發(fā)了一種無乳鏈球菌快速分離診斷試劑盒，可以降低分離無乳鏈球菌的成本和時(shí)間。

5 存在的問題和應(yīng)用前景

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，PCR診斷技術(shù)在奶牛乳房炎病原菌檢測中也取得了可喜的進(jìn)展，但不同類型的PCR診斷法均存在一些問題。普通PCR診斷法盡管靈敏度較高，特異性較強(qiáng)，但是一次只能診斷一種病原菌，難以實(shí)現(xiàn)對多種病原菌感染進(jìn)行檢測。多重PCR診斷技術(shù)雖然克服了普通PCR診斷法一次只能診斷一種病原菌的缺陷，實(shí)現(xiàn)了在較大范圍內(nèi)同時(shí)檢測出多種病原菌，但相對于普通PCR，其靈敏度下降明顯，因此需對整個(gè)PCR反應(yīng)體系（包括引物濃度、Taq酶濃度、退火溫度及延伸時(shí)間等）進(jìn)行全面的優(yōu)化。同時(shí)如何排除PCR抑制物，并有效提取病原菌的DNA也給技術(shù)開發(fā)者帶來了一定挑戰(zhàn)。此外，與普通PCR診斷法相同，多重PCR診斷法也只能對病原菌進(jìn)行定性檢測，而不能定量地顯示出細(xì)菌的數(shù)量。Real-time PCR技術(shù)與前兩者相比較，在提升靈敏度的同時(shí)，也可以顯示出乳房炎樣品中的病原菌數(shù)量，具有較明顯的優(yōu)勢。但是，Real-time PCR成本較高，且各實(shí)驗(yàn)室無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，限制了其在基層牛場或獸醫(yī)站的推廣應(yīng)用。巢氏PCR有2次PCR擴(kuò)增，大大降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，增加了檢測的特異性、提高了檢測的靈敏度，但是該技術(shù)在第一輪擴(kuò)增結(jié)束后需要打開PCR管蓋添加第2對引物，增加了反應(yīng)體系被污染的可能。商業(yè)化PCR檢測試劑盒雖然能夠大批量地應(yīng)用于臨床的快速診斷，但使用過程中的反復(fù)凍融能夠影響酶、引物、模板的活性和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。因此，PCR檢測試劑盒在保存過程中的重復(fù)性和穩(wěn)定性成為試劑盒研發(fā)的技術(shù)難題。

雖然PCR診斷法在奶牛乳房炎的診斷中存在著一系列的問題，但由于該方法具有檢出率高、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，迎合了早發(fā)現(xiàn)、早治療的理念，因此，該方法在奶牛乳房炎診斷上已呈現(xiàn)出廣闊的前景。隨著研究水平的不斷深入，研究技術(shù)與方法的不斷完善，一定能研發(fā)出更完善的、實(shí)用性更強(qiáng)的分子生物學(xué)診斷方法，從而對乳房炎疾病做出快速、準(zhǔn)確的判斷，創(chuàng)造出巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

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Research Progress in PCR Diagnosis Technology of Bovine Mastitis Pathogens

WangDan，Yang Feng，Li Hongsheng，et al
（Lanzhou Institute ofAnimal Husbandry and Pharmaceutical Sciences of Chinese Academy ofAgricultural Sciences；Key Laboratory ofVeterinary Pharmaceutical Discovery，Ministry ofAgriculture；Key Laboratory ofNewAnimal Drug Project ofGansu Province，Lanzhou 730050，China）

Dairy cowmastitis is a common disease affecting the development of dairy industry. It causes serious economic loss to dairy farming，and affects the yield and quality of milk，endangers human health.At present，the antibiotics were abused in the treatments of dairy cowmastitis with unclearing pathogens caused，resulting in increasement of pathogen resistance and decreasement of the treatment effects.There are a few shortcomings in traditional detection method for mastitis pathogen dignosis，such as complicated operation，time- consuming，lowsensitivity and no effect on pathogens in milk samples of antibiotics，so that a rapid，sensitive and simple detection method is urgently needed.The rapid diagnosis of mastitis are crucial for the effectively treatment of the dairy cowmastitis. In order to provide theoretical basis for developing rapid，specific and sensitive diagnosis of dairy cow mastitis pathogens，the author summarized the traditional PCR，multiplex PCR，real time PCR，nested PCR and detection kit etc，and analyzed the advantages and disadvantages of these methods.

PCR；cow；mastitis；pathogenic bacteria

S858.23

A

2095-3887（2017）01-0047-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.01.015

2016-11-14

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃（2012BAD12B03）；甘肅省科技支撐計(jì)劃（144NKCA240）；甘肅省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（GNCX-2013-59）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛疾病研究創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-03）

王丹（1991-），女，碩士研究生。

李宏勝（1964-），男，研究員，博士。研究方向：奶牛乳房炎免疫及預(yù)防。