李 斌 呂 政 曾憲海 戈文東

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激光捕獲顯微切割結(jié)合低體積擴(kuò)增技術(shù)研究*

李 斌1呂 政2曾憲海1戈文東1

1. 福建省公安廳刑事技術(shù)總隊(duì)，福建省刑事科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 2. 福州市鼓樓區(qū)公安分局刑事技術(shù)大隊(duì)

目的：研究激光捕獲顯微切割技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用低體積擴(kuò)增技術(shù)，建立一套微量混合樣本DNA的檢驗(yàn)方法。方法：使用PALM系統(tǒng)切割捕獲目標(biāo)細(xì)胞，彈射到低體積擴(kuò)增玻片的反應(yīng)位點(diǎn)上，消化細(xì)胞，提取DNA，使用Identifiler?試劑盒在1.5μL體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果：分別捕獲10個(gè)口腔上皮細(xì)胞、20個(gè)精子細(xì)胞，成功獲得16個(gè)完整的STR 基因座分型譜帶。結(jié)論：激光捕獲顯微切割技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用低體積擴(kuò)增技術(shù)適用于法醫(yī)學(xué)中微量混合樣本DNA檢驗(yàn)。

法醫(yī)物證學(xué) 激光捕獲顯微切割 低體積擴(kuò)增 STR分型

激光捕獲顯微切割（Laser capture microdissection, LCM）技術(shù)主要應(yīng)用于病理學(xué)、腫瘤學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)中，可以從復(fù)雜組織中快速準(zhǔn)確地分離均一性樣品組分[1,3]。因其可在顯微鏡直視下捕獲目標(biāo)細(xì)胞，以排除異質(zhì)性細(xì)胞的影響，為解決困擾法醫(yī)物證檢驗(yàn)的難題——混合樣品DNA的檢驗(yàn)分析提供新的解決方案，受到了法醫(yī)科學(xué)工作者的重視與應(yīng)用。而低體積擴(kuò)增技術(shù)（如安利快得系統(tǒng)）采用顯微鏡玻片平面印刷技術(shù)，整個(gè)PCR反應(yīng)體系為1μL，半球狀的空間構(gòu)象為微量反應(yīng)提供了最佳的環(huán)境，使靈敏度大大提高[4]。本實(shí)驗(yàn)將激光捕獲顯微切割和低體積擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，建立微量混合樣本DNA的檢驗(yàn)方法，探討其在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)中應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

樣本一：志愿者口腔拭子。

樣本二：實(shí)際強(qiáng)奸案件中的衛(wèi)生紙。

1.2 主要儀器和試劑

PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)（Carl Zeiss公司，德國)，PEN1.0玻片，AG480F AmpliGrid微量反應(yīng)玻片與密封油，0.04mol/L PK溶液，0.05g/ml龍膽紫染液（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國），Identifiler?試劑盒（Life Technologies公司，美國），AmpliSpeed ASN400 PCR擴(kuò)增儀（Olympus歐洲生命科學(xué)公司，德國），離心機(jī)，ABI 3130XL型遺傳分析儀（Life Technologies公司，美國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1制備細(xì)胞懸液

在樣本一放入加有700μL去離子水的EP管內(nèi)，震蕩洗脫5min，使拭子上的細(xì)胞充分脫落，棄去拭子。

用剪刀剪取1cm×1cm大小樣本二置于EP管內(nèi)，剪碎，加1mLTNE室溫浸泡30min，期間不斷震蕩，套管離心去除載體。

1.3.2涂片

細(xì)胞懸液13000r/min離心3min，吸取上清液，保留約30μL，加入適量的龍膽紫染液，混勻染色5min。吸取5μL，輕輕涂鋪在PEN1.0玻片上，用熱快37℃烘干10～15min。

1.3.3切割

將玻片放置在PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)的載物臺(tái)上，顯微鏡下查找選擇結(jié)構(gòu)清晰、完整的單個(gè)細(xì)胞（樣本一為口腔上皮細(xì)胞，樣本二為精子細(xì)胞），用繪制工具，通過軟件依次選定標(biāo)記需要分離的目標(biāo)細(xì)胞，切割細(xì)胞。切割的激光束能量要適中，以切割后膜面在視野中稍變模糊為宜。

1.3.4收集

切割下的口腔上皮細(xì)胞彈射到加0.75μL PK溶液的AG480F AmpliGrid微量反應(yīng)玻片位點(diǎn)上。切割下的精子細(xì)胞彈射到加0.75μL含有PK和DTT的裂解液（0.1mg/mL PK，5mmol/L DTT）的AG480F AmpliGrid微量反應(yīng)玻片位點(diǎn)上。分別捕獲5、10、15、20、30個(gè)細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞數(shù)重復(fù)3次。

1.3.5 DNA提取

5 μL密封油密封玻片位點(diǎn)，靜置5min，待反應(yīng)液沉到玻片上后，口腔上皮細(xì)胞56℃消化1h，95℃變性15min；精子細(xì)胞56℃消化2h，99℃變性10min。

1.3.6擴(kuò)增

加入0.75μL PCR反應(yīng)液（Identifiler?試劑盒，配比為：Mix 4μL；Primer 2μL；Golden酶1μL），置于AmpliSpeed ASN400 PCR擴(kuò)增儀上擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為1.5μL，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 11min、94℃ 1min、59℃ 1min、72℃ 1min、30個(gè)循環(huán)[5]；60℃延伸1h；4℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物全部上樣，經(jīng)ABI 3130XL型遺傳分析儀檢測，GeneMapper ID v3.2分析檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

捕獲5、10、15、20、30個(gè)細(xì)胞，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，所獲圖譜峰高高于100RFU為標(biāo)準(zhǔn)，DNA檢測結(jié)果見表1。其中等位基因丟失率=等位基因丟失條帶總數(shù)/預(yù)計(jì)等位基因總條帶×3次實(shí)驗(yàn)；位點(diǎn)丟失率=出現(xiàn)等位基因丟失的位點(diǎn)數(shù)/16個(gè)位點(diǎn)×3次實(shí)驗(yàn)；完整檢出率=有效分型次數(shù)/3次實(shí)驗(yàn)。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，P<0.05，不同細(xì)胞數(shù)量實(shí)驗(yàn)組檢出率的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 捕獲不同數(shù)量細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

結(jié)果顯示，對志愿者口腔上皮細(xì)胞，采用PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)捕獲目標(biāo)細(xì)胞，結(jié)合低體積擴(kuò)增技術(shù)，捕獲5個(gè)口腔上皮細(xì)胞，有1次擴(kuò)增在D18S51基因座上雜合子13/17變成純合子13，等位基因丟失率為1.23%。捕獲10個(gè)以上的口腔上皮細(xì)胞，3次平行擴(kuò)增，均穩(wěn)定獲得Identifiler?試劑盒所包含的15個(gè)STR與Amelogenin基因座的基因分型，完整檢出率為100%（見圖1、圖2）。隨著細(xì)胞數(shù)目的增多，擴(kuò)增產(chǎn)物的檢驗(yàn)峰值提高。

圖1 5個(gè)口腔上皮細(xì)胞的STR分型結(jié)果

圖2 10個(gè)口腔上皮細(xì)胞的STR分型結(jié)果

對于強(qiáng)奸案件中的衛(wèi)生紙，采用PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)捕獲目標(biāo)細(xì)胞，結(jié)合低體積擴(kuò)增技術(shù)，捕獲5個(gè)精子細(xì)胞，僅5～6個(gè)基因座檢測出條帶，等位基因丟失嚴(yán)重，達(dá)79.01%。捕獲10個(gè)細(xì)胞，大部分基因座出現(xiàn)等位基因丟失，且每次都在不同的基因座上出現(xiàn)等位基因丟失，無法獲得完整的STR分型圖譜，等位基因丟失率為49.85%。隨著捕獲細(xì)胞數(shù)目的增多，完整檢出率逐漸提高，而等位基因丟失率逐漸降低。捕獲15個(gè)精子細(xì)胞，2次擴(kuò)增出現(xiàn)2～3個(gè)基因座等位基因丟失現(xiàn)象，雜合子變成純合子，等位基因丟失率為6.17%。捕獲20個(gè)以上的精子細(xì)胞3次平行擴(kuò)增，才可獲得完整的STR分型結(jié)果圖，如圖3～圖6所示。

圖3 5個(gè)精子細(xì)胞的STR分型結(jié)果

圖4 10個(gè)精子細(xì)胞的STR分型結(jié)果

圖5 15個(gè)精子細(xì)胞的STR分型結(jié)果

圖6 20個(gè)精子細(xì)胞的STR分型結(jié)果

3 討論

微量混合樣品DNA的檢驗(yàn)和分析一直是法醫(yī)物證檢驗(yàn)的難題。在微量混合樣品中，有時(shí)犯罪嫌疑人的信息為被 害人的信息所掩蓋，無法獲得犯罪嫌疑人的基因型，有時(shí)得到的DNA分型結(jié)果為混合基因型，不能達(dá)到認(rèn)定水平。而PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)與低體積擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合，能從微量混合樣品中收集單一種類細(xì)胞，使常規(guī)方法難以成功分型的樣本也能獲得單一樣本的STR分型結(jié)果，對案件的認(rèn)定意義重大[6]。

本實(shí)驗(yàn)使用的PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)，其核心功能是激光彈射，激光通過高數(shù)值孔徑的物鏡集中在1μm大小的點(diǎn)上，在1ns內(nèi)激光脈沖釋放出的能量，將細(xì)胞切割下來。切割好的細(xì)胞彈射收集到AmpliGrid玻片，整個(gè)過程由激光完成，無接觸、無污染。AmpliGrid玻片采用平面印刷技術(shù)，表面構(gòu)建48個(gè)1μL親水性基因座，使DNA模板、反應(yīng)物錨定在特定位置上，覆蓋4～5μL封閉液體避免液體蒸發(fā)，構(gòu)成最佳的半球狀反應(yīng)空間。同時(shí)疏水性基因座使覆蓋在反應(yīng)試劑上的封閉液互相隔離，亦保證無氣溶膠、無交叉污染。再配合專門為AmpliGrid玻片設(shè)計(jì)的AmpliSpeed ASN400 PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行低體積擴(kuò)增，相較于常規(guī)擴(kuò)增，節(jié)省了試劑，提高了樣本在擴(kuò)增體系中的濃度，使得實(shí)驗(yàn)的靈敏度和成功率得到提升。在本實(shí)驗(yàn)中，我們僅需捕獲10個(gè)口腔上皮細(xì)胞、20個(gè)精子細(xì)胞數(shù)，就能獲得完整的STR分型圖譜，這是常規(guī)PCR擴(kuò)增難以實(shí)現(xiàn)的。

特別是利用PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)將精子細(xì)胞捕獲到反應(yīng)位點(diǎn)上，直接進(jìn)行裂解擴(kuò)增，省去了傳統(tǒng)差異裂解消化女性物質(zhì)的步驟，大大縮短檢驗(yàn)時(shí)間，簡化了操作步驟，避免了污染和精子細(xì)胞的損失。同時(shí)，該系統(tǒng)準(zhǔn)確捕獲精子細(xì)胞，排除了女性物質(zhì)的干擾，使分型結(jié)果由混合型變成單一型，極大提高了現(xiàn)場物證的證據(jù)價(jià)值，為強(qiáng)奸案件中女性成分去除不干凈的混合斑提供了一個(gè)有效的解決方案。

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，捕獲精子細(xì)胞數(shù)為20個(gè)時(shí)，才能獲得完整的STR分型圖譜，而口腔上皮細(xì)胞僅需10個(gè)就可以。亓冰通過顯微操作法，聯(lián)合安利快得系統(tǒng)，使用Identifiler?試劑盒在3個(gè)口腔上皮細(xì)胞就能獲得完整的STR分型[7]。我們認(rèn)為，檢材的新鮮程度對結(jié)果有很大的影響。本實(shí)驗(yàn)中，口腔上皮細(xì)胞采用的是志愿者口腔拭子，細(xì)胞新鮮，是理想狀態(tài)下的細(xì)胞。而精子細(xì)胞使用的是實(shí)際案件中的檢材，由于保存條件、保存時(shí)間、載體類型和雜質(zhì)等干擾因素的存在，在顯微鏡下看到部分細(xì)胞核破損，不完整，甚至是無細(xì)胞核的細(xì)胞，這說明樣本不新鮮，細(xì)胞已開始部分降解。其次，精子細(xì)胞是單倍體，僅含有一半的基因組信息，當(dāng)細(xì)胞數(shù)目少時(shí)，很難均衡提取到兩種單倍體的細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)目多時(shí)，完整分型的可能性就增加[8]。

本實(shí)驗(yàn)室使用的PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)相較于其它需借助針尖或微細(xì)管來分離細(xì)胞的顯微分離技術(shù)相比，具有分離細(xì)胞速度快、無需精巧的操作技能的優(yōu)點(diǎn)[8]。但筆者在實(shí)際操作PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)時(shí)，通過反復(fù)試驗(yàn)，亦總結(jié)了一些小技巧，如：制備細(xì)胞懸液后加龍膽紫染色劑時(shí)，染色劑要離心，避免帶入染色劑顆粒，影響制片。制片后宜立即進(jìn)行激光切割捕獲細(xì)胞，否則容易影響細(xì)胞捕獲效果。添加擴(kuò)增液時(shí)使用小槍頭，擴(kuò)增液在槍頭形成小液滴，然后輕觸密封油頂端，使其自行融入樣本溶液中。靜置檢查每個(gè)擴(kuò)增點(diǎn)頂端是否被油膜重新封住，如果沒有封住，則需加少量密封油，可避免擴(kuò)增過程中出現(xiàn)吹氣泡現(xiàn)象，導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。

通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，本文構(gòu)建的激光顯微切割捕獲系統(tǒng)聯(lián)合低體積擴(kuò)增的方法，將前者的精確捕獲細(xì)胞功能和后者的高靈敏度擴(kuò)增特點(diǎn)有機(jī)結(jié)合，可解決微量混合檢材DNA檢驗(yàn)問題。但在實(shí)際案件中，由于檢材載體的復(fù)雜性、保存條件的差異性，方法還需進(jìn)一步摸索和完善。

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