孔維健,常宇鑫,昝春芳,鄭 爽，楊小玉

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 骨科，吉林 長春130041)

基于Cre-loxP系統(tǒng)條件性基因敲除小鼠的構(gòu)建及其應(yīng)用進(jìn)展

孔維健,常宇鑫,昝春芳,鄭 爽*，楊小玉*

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 骨科，吉林 長春130041)

隨著科研技術(shù)水平的不斷提高，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在基礎(chǔ)實驗研究中得到了廣泛的應(yīng)用，基因敲除技術(shù)是轉(zhuǎn)基因技術(shù)中不可替代的組成部分，而條件性基因敲除技術(shù)作為新一代基因敲除技術(shù)，與第一代基因敲除技術(shù)相比顯然有著明顯的優(yōu)勢和更為廣泛的應(yīng)用前景。其中基于Cre-loxP系統(tǒng)的條件性基因敲除小鼠因其良好的實驗效果得到了許多研究的青睞，現(xiàn)已有多篇相關(guān)文獻(xiàn)的成功報道。但Cre-loxP系統(tǒng)作為一項新技術(shù)，其相關(guān)原理及應(yīng)用歸納尚不完善，在不同實驗中構(gòu)建Cre-loxP系統(tǒng)條件性基因敲除小鼠的具體方法也有所差異。本文以條件性基因敲除技術(shù)中典型的Cre-loxP系統(tǒng)為中心，通過查閱回顧相關(guān)文獻(xiàn)，歸納出Cre-loxP系統(tǒng)的基本作用原理和應(yīng)用該系統(tǒng)構(gòu)建條件性基因敲除小鼠的一般方法，并對Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建的基因敲除小鼠在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的應(yīng)用加以分類，綜述如下。

1 cre-loxp系統(tǒng)基本作用原理

1.1Cre重組酶(CyclizationRecombinationEnzyme)和loxP(locusofX-overP1)序列

Cre重組酶是大腸桿菌噬菌體P1中cre基因編碼表達(dá)的由343個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量為38000的蛋白質(zhì)[1]。它可以特異性識別細(xì)胞內(nèi)基因或DNA上的loxP序列，并根據(jù)loxP序列的位置和loxP序列之間的關(guān)系介導(dǎo)不同的特異性重組反應(yīng)。loxP序列是從大腸桿菌P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)的長34 bp的堿基序列，由兩個13bp的反向重復(fù)序列和中間8 bp的間隔序列組成。它是Cre重組酶的特異性識別結(jié)合位點，具體序列如下[2]：5′-ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT-3′；3′-TATTGAAGCATAT-CGTATGTA-ATATGCTTCAATA-5′。

1.2Cre-loxP系統(tǒng)的特性

Cre重組酶介導(dǎo)的兩個loxP序列間的特異性重組根據(jù)序列位置和方向的不同分為三種情況：當(dāng)兩個loxP序列位于同一條DNA鏈且方向相同時，Cre重組酶能夠敲除兩個loxP序列間的DNA片段；當(dāng)兩個loxP序列位于同一條DNA鏈且方向相反時，Cre重組酶能夠倒轉(zhuǎn)兩個loxP序列間的DNA片段；當(dāng)兩個loxP序列位于不同DNA鏈上時，Cre重組酶能夠介導(dǎo)loxP序列間DNA鏈的交換或染色體易位[3]。在實驗設(shè)計中實驗者可以根據(jù)不同的研究需要選擇相應(yīng)的序列構(gòu)建方式，來達(dá)到相應(yīng)的目的。

2 條件性基因敲除小鼠的構(gòu)建

應(yīng)用Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建條件性基因敲除小鼠主要分為兩個主要部分：構(gòu)建具有l(wèi)oxP序列的目的基因突變小鼠和構(gòu)建帶有Cre酶基因的轉(zhuǎn)基因Cre小鼠[4]。兩種小鼠雜交后經(jīng)篩選可得到細(xì)胞內(nèi)同時存在Cre重組酶基因和loxP序列的小鼠，通過條件性表達(dá)Cre重組酶并與細(xì)胞內(nèi)loxP序列特異性識別，刪除相應(yīng)的基因或基因片段，從而完成條件性基因敲除小鼠的構(gòu)建。

2.1loxP突變小鼠的構(gòu)建

通過查閱數(shù)據(jù)庫，獲取欲敲除目的基因或基因片段的相關(guān)序列信息，在基因的非編碼區(qū)或編碼區(qū)內(nèi)含子中選擇距離和長度適宜的兩個區(qū)域插入loxP序列。在上游區(qū)域插入loxP序列，在下游區(qū)域插入loxP序列及正篩標(biāo)記基因和負(fù)篩標(biāo)記基因，構(gòu)建出結(jié)構(gòu)為“同源序列-loxP-目的基因或基因片段-正篩標(biāo)記基因-loxP-同源序列-負(fù)篩標(biāo)記基因”的DNA片段作為打靶載體[5]。將純化后的打靶載體通過電穿孔、顯微注射或病毒轉(zhuǎn)染的方法注入小鼠胚胎干細(xì)胞中，得到攜帶loxP突變基因的靶細(xì)胞。三種技術(shù)各有其優(yōu)劣：電穿孔法轉(zhuǎn)化效率較高、操作較為簡單，但其效率隨質(zhì)粒DNA片段長度和大小的增加而降低[6]；顯微注射法技術(shù)較為成熟，DNA片段長度對轉(zhuǎn)化效率影響較小，適用于長度較長的DNA片段，但技術(shù)相對復(fù)雜，轉(zhuǎn)化效率低于電穿孔法和病毒轉(zhuǎn)染[7]；病毒轉(zhuǎn)染法效率高，特異性強，但對小鼠發(fā)育和健康有一定影響，且攜帶的外源基因片段長度一般較小，多不超過7 kb[8]。

根據(jù)同源重組，帶有l(wèi)oxP序列的突變基因或突變基因片段將有部分整合到細(xì)胞的基因中。注入后通過正負(fù)篩選法篩選出導(dǎo)入打靶載體DNA片段的中靶細(xì)胞。應(yīng)用顯微注射法將中靶細(xì)胞注入小鼠囊胚內(nèi)，將囊胚植入假孕小鼠子宮，發(fā)育得到帶有l(wèi)oxP突變基因的嵌合體小鼠[9]。取小鼠尾部細(xì)胞培養(yǎng)，PCR擴增后通過DNA印跡法確認(rèn)loxP突變基因已整合到小鼠染色體上。將嵌合體小鼠同野生型小鼠雜交，根據(jù)孟德爾遺傳定律，有25%的幾率得到帶有突變基因的雜合突變小鼠，通過DNA印跡法篩選出帶有突變基因的雜合突變小鼠。將雜合突變小鼠自交，得到兩條染色體均帶有l(wèi)oxP突變基因的純合突變小鼠。

2.2轉(zhuǎn)基因Cre小鼠的構(gòu)建

Cre小鼠的構(gòu)建基本原理與loxP突變小鼠基本一致。首先，根據(jù)實驗研究目的選取特定的啟動子，如lck啟動子(胸腺細(xì)胞)[10]、晶狀體球蛋白啟動子(眼晶狀體)[11]、鈣調(diào)素依賴性激酶Ⅱ啟動子(海馬和大腦新皮質(zhì))[12]、乳清酸性蛋白啟動子(乳腺)[13]、aP2啟動子(脂肪組織)[14]、AQP2啟動子(腎臟集合管)[15]和肌漿蛋白啟動子(骨骼肌)等，使Cre酶只在特定的組織器官和細(xì)胞中表達(dá)。以噬菌體P1的基因組為模板，設(shè)計引物擴增出Cre重組酶的基因片段，構(gòu)建出帶有Cre重組酶基因的DNA片段打靶載體，并根據(jù)需要引入外源性調(diào)控因子，如干擾素反應(yīng)Mx1啟動子[16]、他莫昔芬依賴的雌激素突變體啟動子[17]和四環(huán)素調(diào)節(jié)系統(tǒng)[18]等。由外源性調(diào)控因子介導(dǎo)的基因敲除可以減少在實驗動物胚胎發(fā)育早期由于關(guān)鍵基因功能異常所產(chǎn)生的副作用，從而實現(xiàn)時間上的特異性調(diào)控。將純化后的打靶載體導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞或受精卵中，篩選后得出中靶細(xì)胞，將中靶細(xì)胞導(dǎo)入假孕小鼠子宮，發(fā)育后得到帶有Cre基因的雜合突變小鼠。

2.3基因敲除小鼠的構(gòu)建

將雜合的轉(zhuǎn)基因Cre突變小鼠同純合loxP突變小鼠雜交，由于Cre重組酶表達(dá)后可以特異性識別DNA中的loxP位點并切除位點間的DNA片段，根據(jù)孟德爾遺傳定律，小鼠出生后，經(jīng)PCR鑒定將有50%的幾率得到條件性基因敲除的雜合子小鼠F1；將F1代小鼠自交或與純合loxP突變小鼠雜交，即可得到條件性基因敲除的純合子小鼠F2，完成條件性基因敲除小鼠的構(gòu)建。

3 Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建基因敲除小鼠的應(yīng)用

3.1人類動物疾病模型的構(gòu)建

人類疾病由于環(huán)境、基因等多方面因素的影響，其發(fā)生機制和影響因素都較為復(fù)雜，通過構(gòu)建人類疾病的動物模型，可以更方便更有效的認(rèn)識人類疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，研究疾病的相關(guān)防治措施并對措施的效果加以評價。通過特異性敲除疾病相關(guān)的目的基因，引起特定的蛋白或細(xì)胞因子缺失來構(gòu)建出自發(fā)性動物疾病模型現(xiàn)在已得到越來越多人的認(rèn)同。應(yīng)用Cre-loxP系統(tǒng)可以實現(xiàn)在特定類型的組織或器官中特異性敲除目的基因，避免了某些與生長發(fā)育相關(guān)的基因敲除所導(dǎo)致的胚胎致死問題，在人類動物疾病模型的構(gòu)建上有著明顯優(yōu)勢，并有多篇文獻(xiàn)的成功報道。例如利用Cre-loxP條件性敲除小鼠Osterix基因得到先天性脊柱側(cè)凸小鼠模型，研究osterix基因在先天性脊柱側(cè)凸發(fā)病中的作用，并應(yīng)用所構(gòu)建的模型探索先天性脊柱側(cè)突的治療方法[19]；通過條件性敲除p53/LKB1雙基因構(gòu)建出子宮內(nèi)膜癌小鼠模型，研究子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與發(fā)展[20]；應(yīng)用Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建Alb-cre/DTR雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型，并在此基礎(chǔ)上建立可誘導(dǎo)型肝損傷模型，用于肝臟疾病的相關(guān)研究[21]等。這些研究均展現(xiàn)出了Cre-loxP系統(tǒng)條件性基因敲除小鼠在人類動物疾病模型構(gòu)建中的良好效果。

3.2基因功能鑒定

為了研究某一特定基因在機體內(nèi)的具體作用及功能，往往需要抑制該基因表達(dá)或敲除該目的基因，直接敲除目的基因與利用外界化學(xué)或生物條件抑制基因表達(dá)相比，其效果更明確具體，更能直觀的反應(yīng)基因的作用。如利用cre-loxP條件性基因敲除技術(shù)構(gòu)建血管內(nèi)敲除cdc42基因雜合子小鼠，為進(jìn)一步在整體動物水平研究cdc42在維持微血管屏障中的作用提供了平臺[22]；通過條件性敲除Rb基因，研究其在調(diào)控耳蝸支持細(xì)胞增殖中的作用及機制[23]；以及利用Cre-loxP特異性敲除Pdx1基因，通過檢測Pdx1基因表達(dá)或缺失的胰島細(xì)胞分化發(fā)育的情況，探討Pdx1基因在胰島素分泌細(xì)胞分化調(diào)控中的作用[24]等研究。在這些研究中通過利用Cre-loxP條件性基因敲除小鼠，構(gòu)建出目的基因缺失的個體，通過與正常小鼠相比較，發(fā)現(xiàn)目的基因在個體生長發(fā)育中的具體作用。

3.3病毒發(fā)病機制及抗病毒免疫研究

基因敲除小鼠技術(shù)的發(fā)展使得科學(xué)家們對病毒宿主相互作用中病毒的發(fā)病原因及宿主抗病毒免疫機制有了更深刻的理解，例如，表達(dá)抗原特異性的、主要的組織相容性復(fù)合體(MHC)受限T細(xì)胞受體(TCR)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型已經(jīng)被廣泛用于研究病毒特異性T細(xì)胞反應(yīng)[25]；而且由于小鼠對許多人類病毒缺乏易感性，通過制備具有人類病毒特異性受體的轉(zhuǎn)基因小鼠來研究這些病毒的作用機制；科學(xué)家還可以通過敲除特定的基因或目標(biāo)細(xì)胞群來研究在控制病毒感染中起決定性作用的免疫應(yīng)答細(xì)胞和分子組分[26]。

4 Cre-loxP系統(tǒng)應(yīng)用的優(yōu)勢與不足

Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建的條件性基因敲除小鼠現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、人類動物疾病模型復(fù)制及人類疾病發(fā)病機制、基因功能鑒定和表型研究等領(lǐng)域[27]。與完全基因敲除小鼠相比，條件性基因敲除小鼠具有時間和空間可控性，可以在特定藥物、蛋白、激素或基因的作用下實現(xiàn)體內(nèi)特定種類器官或組織中的基因敲除，避免了某些基因完全敲除所導(dǎo)致的胚胎致死效應(yīng)，具有良好的應(yīng)用價值。

Cre-loxP系統(tǒng)在理論上已十分成熟，但在實際應(yīng)用中仍存在不足和限制。由于在Cre-loxP系統(tǒng)介導(dǎo)的條件性基因敲除小鼠的構(gòu)建中需要通過同源重組將DNA片段整合到細(xì)胞基因組中，而細(xì)胞內(nèi)發(fā)生非同源重組的幾率遠(yuǎn)大于發(fā)生同源重組的概率，所以需要通過大量的篩選工作將發(fā)生同源重組的細(xì)胞選擇出來，需要大量的時間和精力，影響了實驗的效率；此外，Cre酶作為一種外源性重組酶，在哺乳動物中表達(dá)后具有一定的潛在毒性，Loonstra等人在2001年的研究顯示，Cre酶會引起細(xì)胞增殖異常、DNA錯配和染色體缺失等問題[28]；在體外載體構(gòu)建的過程中雖然通過引入特定的啟動子和增強子等操縱元件縮小了Cre酶在體內(nèi)表達(dá)的部位和范圍，但Cre酶仍在其他細(xì)胞中有少量表達(dá)，表達(dá)的Cre酶會引起其他細(xì)胞內(nèi)的基因敲除和丟失，干擾實驗效果[29]；最后，Cre重組酶特異性識別loxP序列并介導(dǎo)序列間的序列切除的過程是可逆的，其正向切除效率雖然高達(dá)70%-95%，但在目的器官或組織中仍有少量敲除基因未被敲除，這些未敲除的目的基因會在特定器官或組織內(nèi)微量表達(dá)，繼而對實驗結(jié)果產(chǎn)生一定影響[30]。為了減少和降低由Cre-loxP系統(tǒng)自身帶來的負(fù)面影響，可以通過對打靶載體進(jìn)行修飾，例如引入其他位點特異性重組系統(tǒng)如Flp-frt、Dre-rox和φC31等來提高Cre酶表達(dá)特異性[31]，延長載體兩端同源序列的長度來增加載體同源重組的幾率等處理方法來提高實驗構(gòu)建效果。

5 總結(jié)

Cre-loxP系統(tǒng)作為一種特異性位點識別重組系統(tǒng)，有較為明確的技術(shù)原理，具有位點識別準(zhǔn)確、特異性強、無需其他輔酶催化等優(yōu)勢。通過分別構(gòu)建Cre轉(zhuǎn)基因小鼠和loxP突變小鼠，在小鼠體內(nèi)引入Cre重組酶基因，并在欲敲除的基因或基因片段兩端引入loxP序列，通過雜交構(gòu)建出體內(nèi)同時含有Cre重組酶基因和loxP序列的條件性基因敲除小鼠。通過藥物或激素等物質(zhì)介導(dǎo)Cre酶重組酶在小鼠體內(nèi)實現(xiàn)空間和時間上的特異性表達(dá)，識別特定組織或器官細(xì)胞內(nèi)基因組上的loxP序列并敲除序列間的目的基因或目的基因片段，達(dá)到條件性基因敲除的目的。通過Cre-loxP構(gòu)建條件性基因敲除小鼠，可以應(yīng)用于人類動物疾病模型構(gòu)建、基因功能鑒定、抗病毒免疫研究等諸多方面，具有良好的應(yīng)用前景。

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國家自然科學(xué)基金(31572217)

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2208-04

2017-03-11)