孫大菊，劉穎男，呂惠影，王雅麗，張玉成*

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 病理科，吉林 長春130033;2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 科學研究中心，吉林 長春130033；3.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 輸血科，吉林 長春 130033)

長春地區(qū)120例健康成人外周血T淋巴細胞亞群的參考范圍

孫大菊1，劉穎男2，呂惠影2，王雅麗3*，張玉成2*

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 病理科，吉林 長春130033;2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 科學研究中心，吉林 長春130033；3.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 輸血科，吉林 長春 130033)

外周血T淋巴細胞亞群的檢測已經(jīng)廣泛應用于多種疾病的診斷、探索疾病的發(fā)病機理、以及指導臨床醫(yī)生觀察病患的發(fā)病規(guī)律和藥物療效觀察等等。流式細胞術是檢測外周血T淋巴細胞亞群的最主要的方法。目前，臨床醫(yī)院和科研機構應用的流式細胞儀主要來自美國的BD和Beckman Coulter公司。但是，各大醫(yī)院及其科研機構應用的機器型號各有不同，并且，市面銷售的熒光抗體廠家繁多，具有臨床資質的流式細胞儀和試劑本就不多。更為重要的，T淋巴細胞亞群與種族、人種、年齡和生活狀態(tài)能具有密切相關。為此，各臨床機構有必要依據(jù)各地的實際情況，建立適合自己實驗室(相關的儀器和試劑)獨立的臨床參考范圍。為此，我們使用Beckman Coulter 公司的流式細胞儀(型號FC 500)和試劑，對長春地區(qū)120例健康成人外周血T淋巴細胞亞群進行檢測，現(xiàn)總結如下。

1 材料與方法

1.1研究對象本研究選取吉林省長春市吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院健康體檢者120名，均為漢族，其中男性62名，女性58名，年齡20-60歲，其中女性平均年齡42.7歲，男性平均年齡41.5歲。所有的健康體檢者均無近期吸煙、飲酒和服藥，均無家族性遺傳史；并且均沒有細菌和病毒感染，HIV、乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒血清學指標均為陰性；心、肝、脾肺腎均未見異常。所有健康體檢者均同意參加外周血T淋巴細胞亞群的檢測，并且此檢測完全符合中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理道德標準。

1.2主要試劑和儀器所有試劑均為美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)。主要包括：四色T淋巴細胞亞群抗體：CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5 (試劑貨號：6607013)；紅細胞裂解液:OptiLyse B No-Wash Lysing Solution (試劑貨號：IM1400)；熒光對照抗體：IgG2b-FITC/IgG1-PE/IgG1-ECD/IgG1-PC5；流式細胞儀：Beckman Coulter公司(型號FC 500)。

1.3樣本處理采集健康體檢者外周血1 ml，加入到帶有EDTA抗凝的真空管中，混勻以防止血液凝固。分別取兩只流式細胞儀上樣管，命名為對照管和實驗管；每管中加入100 μl抗凝全血，分別加入20 μl同型對照抗體和四色T淋巴細胞亞群抗體；充分混勻后，避光室溫孵育20 min；然后向每管中加入紅細胞裂解液500 μl，充分混勻后，室溫避光20 min；加入PBS 500 μl，混勻，1 000 r/min 離心5 min；去掉上清，再重復清洗一次；最后去掉上清，加入500 μl PBS，上機。

1.4上機檢測大體實驗步驟如前所述[1]，簡述如下：打開流式細胞儀，待儀器激光穩(wěn)定后，利用熒光微球上機驗證儀器正常；打開四色程序，利用CD45-FITC圈取淋巴細胞，每份樣本選取細胞數(shù)10000個，樣本采集后，利用CXP Analysis軟件分析CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+占淋巴細胞的百分比。

1.5統(tǒng)計分析統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0進行t檢驗，數(shù)值用均值和標準差表示，P<0.05代表有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1不同性別外周血T淋巴細胞亞群結果(見表1)，結果發(fā)現(xiàn)各項指標之間沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.2不同年齡外周血T淋巴細胞亞群結果分為兩組，分別為20-40歲和40-60歲，結果發(fā)現(xiàn)各項指標在不同年齡組中無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表2。

2.3用百分位數(shù)法獲得120例健康成人外周血T淋巴細胞的95%的可信區(qū)間，以此建立長春地區(qū)健康成人外周血T淋巴細胞亞群的參考范圍，見表3。

表1 不同性別外周血T淋巴細胞亞群結果

表2 不同年齡外周血T淋巴細胞亞群結果

表3 120例長春地區(qū)健康成人外周血T淋巴細胞亞群的參考范圍

3 討論

T淋巴細胞是細胞免疫的重要組成部分，其對維持機體內環(huán)境穩(wěn)定、機體的免疫防御、免疫監(jiān)視等均具有舉足輕重的重要作用。根據(jù)T淋巴細胞表面標志物CD4和CD8的不同，將T淋巴細胞分為CD3+CD4+和CD3+CD8+兩種類型的T淋巴細胞[2]。應用流式細胞術技術檢測外周血T細胞亞群的檢測是臨床上觀察細胞免疫的最常用方法[3]。CD3+CD4+、CD3+CD8+以及CD4/CD8比值的檢測對艾滋病、腫瘤、自身免疫病和移植排斥等疾病的評估、藥物觀察和疾病進展等具有重要的臨床指導意義。但是各地由于使用儀器試劑、民族、地域和年齡的差異，造成T淋巴細胞亞群的參考范圍各有不同。因此，有必要建立適用于本地區(qū)的健康成人外周血T淋巴細胞亞群的參考數(shù)值[4-6]。

本研究利用Beckman Coulter公司的流式細胞儀FC 500，結合四色熒光抗體檢測了120例正常健康人外周血T淋巴細胞亞群，我們的研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細胞亞群在性別和年齡上沒有統(tǒng)計學差異，最后我們利用95%的可信區(qū)間，建立了適合我研究室的T淋巴細胞亞群的參考范圍。與國內發(fā)表的當?shù)亟】党扇薚淋巴細胞亞群參考范圍比較，我們的研究結果與湖南省差距較大[7]，而與北京地區(qū)差異較小[8]，這可能與地域差異有關。在國際上，Lee等[9]研究發(fā)現(xiàn)即便是不同性別的T淋巴細胞亞群也存在著差異，其研究結果顯示男性CD3+CD8+淋巴細胞百分比高于女性，而CD3+和CD3+CD4+淋巴細胞百分比低于女性。

但是我們的研究也存在一些不足之處，第一：樣本量選擇120例健康成人外周血，采取的樣本量不夠大，我們的參考范圍可能不能完全反應本地區(qū)的真實參考數(shù)值。第二：我們應用的儀器及試劑均為Beckman Coulter公司生產(chǎn)的，其他公司(例如BD公司)的檢測結果是否與本室相同未能得知。第三:患者的個體生活環(huán)境未能完全獲得，且我們只選擇了漢族人口作為檢測指標，未能全面包含本地區(qū)少數(shù)民族的檢測結果。

總之，建立本地區(qū)的健康成人外周血T淋巴細胞亞群的參考范圍，具有較重要的臨床指導意義。

[1]曹林林,劉穎男,鄭德明，等.乳腺癌患者手術前后T淋巴細胞亞群變化的實驗研究[J].中國實驗診斷學,2013,17(1):113.

[2]邵 彬,李惠平,邸立軍，等.外周血淋巴細胞亞群監(jiān)測對復發(fā)轉移性乳腺癌的預測及預后價值[J].北京大學學報(醫(yī)學版),2016,48(2):304.

[3]Tomasello E,Pollet E Vu Manh TP,et al.Harnessing Mechanistic Knowledge on Beneficial Versus Deleterious IFN-I Effects to Design Innovative Immunotherapies Targeting Cytokine Activity to Specific Cell Types [J].Front Immunol,2014,5(6):526.

[4]郭曉輝,張 麗,謝世平.艾滋病常見中醫(yī)證型與T淋巴細胞亞群的統(tǒng)計學分析[J].世界中西醫(yī)結合雜志,2016,11(1):52.

[5]童 春,郭 智,樓金星,等.異基因造血干細胞移植后T淋巴細胞亞群監(jiān)測的臨床意義[J].中國實驗血液學雜志,2016,24(1):167.

[6]姚 斕,王燕嬉,張 偉.老年肺癌患者外周血T淋巴細胞亞群和自然殺傷細胞的臨床及意義[J].中國老年學雜志,2016,36(4):860.

[7]何志雄,李木蘭,袁才佳，等.湖南省成人外周血T淋巴細胞亞群的參考范圍[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2014,41(18):3395.

[8]韓呈武,于雪瑩,王麗娜，等.北京地區(qū)健康成人外周血T淋巴細胞亞群的參考范圍[J].臨床檢驗雜志,2009,27(5):390.

[9]Lee BW,Yap HK,Chew FT,et al.Age- and sex-related changes in lymphocyte subpopulations of healthy Asian subjects:from birth to adulthood [J].Cytometry,1996,26(1):8.

吉林省衛(wèi)生計生青年科研項[2014Q25]，白求恩醫(yī)學科研支持計劃項目[2013207058]

*通訊作者;*相同貢獻

1007-4287(2017)12-2160-02

孫大菊(1980-)，女，碩士，主管技師，主要從事細胞病理學診斷及技術。

2017-02-15)