蘇開美，張小雷，李富民，李娥賢，李樹紅**

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650223；2.陸良縣林業(yè)局，云南 陸良 655604）

黑孢塊菌與華山松合成菌根苗技術(shù)初探*

蘇開美1，張小雷1，李富民2，李娥賢1，李樹紅1**

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650223；2.陸良縣林業(yè)局，云南 陸良 655604）

黑孢塊菌（Tuber melanosporum Vittad.）是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的菌根食用菌。通過對(duì)黑孢塊菌與華山松（Pinus armandii Franch.）合成菌根苗的技術(shù)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，用黑孢塊菌孢子液接種華山松樹苗后，第7個(gè)月可觀測(cè)到黃褐色外生菌根。外生菌根為單軸狀或二叉分支狀，單根菌根長0.3 mm～4 mm，直徑為0.3 mm～0.5 mm，表面呈馬賽克鑲嵌結(jié)構(gòu)，其外延菌絲為透明、半透明，呈近直角的分枝。菌根老化后變紅褐色或萎縮。菌根表面呈馬賽克鑲嵌結(jié)構(gòu)、外延菌絲有近直角的分枝是黑孢塊菌與華山松形成菌根的最重要形態(tài)特征。

黑孢塊菌；華山松；顯微結(jié)構(gòu)；共生真菌

黑孢塊菌（Tuber melanosporum Vitt.），原產(chǎn)于歐洲地中海沿岸的法國、意大利及西班牙等國家[1]，是世界上最名貴的珍稀食用菌之一，也是世界上最昂貴的1種黑色塊菌。由于黑孢塊菌子囊果中不僅含有多種氨基酸、微量元素，更主要的是含有獨(dú)特的香味化合物，成熟時(shí)其香味倍受人們喜愛。在法國、意大利是盛大宴會(huì)上款待賓客的佳肴，其價(jià)格不菲，1 000 g新鮮黑孢塊菌售價(jià)高達(dá)1 500歐元以上[2]。歐洲人稱它為森林中的“黑鉆石”。由于其市場(chǎng)價(jià)格高昂導(dǎo)致人們過度采挖，造成資源銳減，供需矛盾突出。因此，開展塊菌人工栽培技術(shù)研究，是近30年來倍受關(guān)注的國際性研究課題之一[2]。

塊菌是1種菌根食用菌（ectomycorrhizal edible fungus），即共生型食用菌。由于這類食用菌生長必須與適宜宿主樹木根系營共生生活，因此其栽培方法有別于腐生型食用菌，在人工栽培上有一定的困難度。法國、意大利和西班牙等國家，從上世紀(jì)70年代先后開始了塊菌的人工栽培研究，并在1974年取得突破性進(jìn)展，其中法國最早實(shí)現(xiàn)了塊菌商業(yè)化生產(chǎn)，為菌根食用菌人工栽培提供了經(jīng)驗(yàn)[3]。其主要方法是在溫室條件下，通過人工接種培育帶有塊菌菌根的菌根化苗木，再將這些幼苗在適合林地上栽種，6年～7年后就可以長出黑孢塊菌[3]。在黑孢塊菌栽培的模式中，菌根化苗的合成與規(guī)模生產(chǎn)就成為其中關(guān)鍵技術(shù)之一。

中國至今未發(fā)現(xiàn)有黑孢塊菌的分布，為了引種黑孢塊菌，利用黑孢塊菌的孢子接種中國的樹種，研究其共生能力及形成菌根化苗的有關(guān)接種技術(shù)，2015年～2017年在溫室條件下開展了有關(guān)研究。本文主要報(bào)道黑孢塊菌對(duì)云南本土樹種華山松幼苗的感染，以及形成菌根化苗木的有關(guān)接種條件，為在田間完成黑孢塊菌的菌根合成奠定基礎(chǔ)。栽培塊菌，接種不同樹種，栽種后出塊菌的時(shí)間及產(chǎn)量是不同的[4]。栽培黑孢塊菌常用的共生樹種都是闊葉樹，如殼斗科（Fagaceae） 和榛科（Corlysaceae） 的樹種[2]，采用華山松作為黑孢塊菌的寄主在世界上未見研究報(bào)道。本研究為黑孢塊菌的人工栽培提供新的寄主植物，希望在中國引種黑孢塊菌的研究中提供新的思路和途徑。

1 材料和方法

1.1 無菌苗的培育

1.1.1 種子

2014年11月中旬從楚雄子溪山采回華山松種子，風(fēng)干。

1.1.2 育苗基質(zhì)

用蛭石與草煤，比例為1∶1（v·v-1）拌勻，含水量為60%，然后高溫高壓（121℃，1.5 kg·cm-2）滅菌[5]。

1.1.3 育苗

2015年2月10日左右在高8 cm，寬40 cm，長60 cm的盆缽中，裝深6 cm的已經(jīng)徹底滅菌的基質(zhì)，華山松種子清水浸泡20 h左右，用0.3%的高錳酸鉀溶液浸泡30 min后，清水沖洗干凈，播種在準(zhǔn)備好的基質(zhì)里，再將滅過菌的基質(zhì)撒在種子上，厚度1.5 cm，盆缽置于溫室中保濕管理。

將以上方法培養(yǎng)的苗用干凈透明膠片包裹后移植到內(nèi)徑為8 cm、高10 cm的育苗缽中，放入日溫20℃～25℃、夜溫18℃～20℃的自然光照塑料大棚內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，用無菌水澆潤基質(zhì)使維持在田間容水量。經(jīng)培養(yǎng)約3個(gè)月后，苗木根系已大部分長至基質(zhì)外圍時(shí)，檢驗(yàn)有無外生菌根污染，無污染的苗木可用于接種[5]。

1.2 菌種

來自新西蘭的黑孢塊菌子實(shí)體（圖1B），粉碎，和無菌水混合制成孢子懸浮液（圖1C）[6]。

1.3 菌根接種

2015年9月23日接種。在每株苗根系周圍用滴管或注射針筒加10 mL孢子懸浮液（孢子懸浮液濃度約為12 000個(gè)·mL-1）。培養(yǎng)期間用無菌水澆水，保持基質(zhì)濕潤[5]。

1.4 菌根觀察及照相

接種后不定期檢測(cè)菌根發(fā)育狀況。隨機(jī)抽取苗木（圖1A），將外生菌根用無菌的小鑷子取下，在體視鏡下用毛刷刷掉泥土，蒸餾水清洗干凈，在體視顯微鏡（日本，OLYMPUS）和光學(xué)顯微鏡（日本NIKON80I）下觀察菌根的形態(tài)和變化，記錄其特征并照相。

1.5 菌根分子檢測(cè)

黑孢塊菌接種華山松無菌苗9個(gè)月后，從被接種樹的須根取長近2 mm的菌根30個(gè)左右，在體視鏡下用毛刷刷掉泥土清洗干凈后，用改進(jìn)的CTAB法提取菌根的 DNA，真菌通用引物 ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，ITS5：5’-GGAAG TAAAAGTCGTAACAAGG-3’，PCR擴(kuò)增 ITS片段，25 μL 反應(yīng)體系包括：2×PCRmix 12.5 μL，10 μmol·L-1的引物各 1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。擴(kuò)增片段測(cè)序之后，序列在GeneBank進(jìn)行Blast比對(duì)，以確定感染華山松形成菌根的真菌是否是黑孢塊菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根特征

黑孢塊菌與華山松形成的菌根形態(tài)見圖1。

2015年9月23日接種，2015年11月5日（接種后第45天）抽取苗木和小根，在體視顯微鏡下觀察，小根有明顯根毛，未形成菌根。2016年4月27日（接種后7個(gè)月） 抽樣調(diào)查，發(fā)現(xiàn)有大量菌根（圖1D）。菌根呈黃褐色，單軸（圖1F） 或者二叉分枝狀（圖1 D和圖1 E)。單根菌根長0.3 mm～4 mm，直徑為0.3 mm～0.6 mm。在顯微鏡下觀察，自菌套（fungus mantle） 延伸出的外延菌絲（emanating hyphae） 近無色（圖1E和圖1F），有呈近直角狀的分枝（圖1G）；其菌根表面呈馬賽克鑲嵌結(jié)構(gòu)。

2.2 菌根感染率檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)苗木接種9個(gè)月后進(jìn)行檢測(cè)[8]。培育200株苗木，隨機(jī)抽取10株，每株苗的根在體式菌下觀測(cè)是否形成菌根。觀測(cè)結(jié)果顯示10株苗中9株形成菌根，菌根生長發(fā)育良好，感染率為90%。

2.3 分子檢測(cè)

測(cè)序峰圖清晰，無重疊峰，說明僅有1種真菌與華山松形成菌根。ITS序列與黑孢塊菌序列的同源性為100%，確定與華山松形成菌根的真菌為黑孢塊菌。

3 討論

黑孢塊菌在自然條件下，主要生長在闊葉樹下，栽培黑孢塊菌也都用闊葉樹做共生樹種[2]。利用黑孢塊菌孢子液接種華山松樹苗，并成功合成了黑孢塊菌的菌根苗，為法國黑孢塊菌種質(zhì)資源的本土化利用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。從形態(tài)學(xué)方面看，華山松和黑孢塊菌形成的菌根與印度塊菌和華山松形成的菌根類似[9]，即外延菌絲呈近直角分枝，其菌根表面呈馬賽克鑲嵌結(jié)構(gòu)[7]。進(jìn)一步通過分子檢測(cè)確認(rèn)是黑孢塊菌形成的菌根，排除了印度塊菌形成的菌根的可能性，使我們的試驗(yàn)結(jié)果可信。分子檢測(cè)十分必要和重要。

[1]劉波，陶愷.地下真菌研究簡(jiǎn)史及我國已知種[J].食用菌，1989，11 （1）：2.

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[4]胡寶元，劉啟福.黑孢塊菌與青剛櫟形成外生菌根之多樣性[J].臺(tái)大實(shí)驗(yàn)林研究報(bào)告，2008，22（1）：55-60.

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[7]林強(qiáng)，冉曉瀟，趙軍，等.黑孢塊菌、夏塊菌菌根苗培育及菌根檢測(cè)技術(shù)研究[J].四川林業(yè)科技，2013，34（1）：41-43.

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Study on Mycorrization of Pinus armandii with Tuber melanosporum

SU Kai-mei1,ZHANG Xiao-lei1,LI Fu-min2,LI E-xian1,LI Shu-hong1
(1.Biotechnology and Germplasm Resources Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming 650223,China;2.Forestry Bureau of Luliang County,Luliang 655604,China)

Tuber melanosporum Vittad.is a mycorrizal mushroom with high economic value.In this paper,production of mycorrhizal seedings of Pinus armandii Franch.with T.melanosporum was studied.The results showed that T.melanosporum formed ectomycorrhizae on the root tips of P.armandii in seven months after inoculation.Ectomycorrhizae were yellowish-brown and became red-bown and atrophied afrer aging.The ectomycorrhizae was monopodial and binary branch with 0.3 mm-0.5 mm in diameter and 0.3 mm-4 mm in length,the surface was mosaic structure,and the emanating hyphae were transparent and translucent,with a branch of nearly right angle.The mosaic surface and emanating hyphae with right angle branching are very important morphological characters of the mycorrhizae formed by T.melanosporum and P.armandii.

Tuber melanosporum;Pinus armandii;microscopic structure;symbiotic fungi

S646.9

A

1003-8310（2017）05-0021-03

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.05.005

云南省環(huán)保廳（2016012）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS20）。

蘇開美（1965-），女，本科，正高級(jí)工程師，主要從事菌根食用菌研究。E-mail:kaimei@sina.com

**通信作者：李樹紅（1978-），男，碩士，副研究員，主要從事珍稀食用菌資源保護(hù)與利用研究。E-mail:shuhongfungi@126.com

2017-07-10