李宏偉， 李 迪， 黑曉英， 丁婷婷， 候荔桉綜述， 賈孟輝審校

綜述

腦缺血再灌注損傷后Notch通路的激活與神經干細胞增殖機制的研究進展

李宏偉1， 李 迪2， 黑曉英1， 丁婷婷1， 候荔桉1綜述， 賈孟輝3審校

Notch通路是進化過程中高度保守的信號轉導通路，其激活不需要第二信使和蛋白激酶的參與，可直接收鄰近細胞的信號并傳導至細胞核，激活相關轉錄因子的表達。Notch通路廣泛存在于脊椎和無脊椎動物中，參與了一系列重要的生理、病理過程。其中，腦缺血再灌注損傷后Notch通路的激活對于腦神經功能的保護作用是近年來研究的熱點。本文重點對腦缺血再灌注損傷后Notch信號轉導通路的激活與神經干細胞增殖之間的關系加以探討研究，同時探討巢蛋白(Nestin)作為神經干細胞的標記蛋白，用于神經干細胞的分離、鑒定和培養(yǎng)，并作為中樞神經系統(tǒng)損傷最早、快速應答敏感指標的分子機制。

1 腦缺血再灌注損傷與Notch通路的激活

1.1 Notch通路概述 Morgan于1917 年在突變的果蠅體內首次發(fā)現(xiàn)了Notch基因，并因這一基因的缺失會導致果蠅翅膀邊緣鋸齒狀缺刻(notches) 而將這一基因命名為“Notch”[1]。Notch信號轉導通路在進化過程中具有高度保守性，其廣泛存在于脊椎和無脊椎動物中，不僅對細胞的增殖和分化起主要的調控作用，同時還參與了一系列重要的生理、病理過程[2]。Notch信號家族包括Notch受體、配體及其相應的細胞內信號分子，這些相關分子和體內生化過程均參與了 Notch 信號轉導通路的調控[3]。迄今為止發(fā)現(xiàn)其受體有Notch1～4共四種亞型，而配體主要有Jagged-1/Jagged-2/Delta-like 1/Delta-like 3和Delta-like 4共五種，當跨膜受體與配體結合后進入細胞，經過γ-secretase分泌酶的剪切作用從而形成Notch信號的真正激活形式NICD(Notch intracellular domain，120KD)，同時NICD與DNA結合蛋白 CBF-1/RBP-J 結合作用于靶基因 HES-1/HES-5等，最終發(fā)揮生物學效應[4]。

1.2 腦缺血再灌注損傷后Notch通路的激活及其作用 Notch信號轉導通路是進化過程中高度保守的通路，與其他信號通路不同的是其激活不需要第二信使和蛋白激酶的參與，可直接收鄰近細胞的信號并傳導至細胞核，激活相關轉錄因子的表達，不具有級聯(lián)放大的特點[5]。這為Notch通路精確調控神經細胞的增殖、分化提供了理論依據。在生理情況下，大腦發(fā)育時Notch通路決定了神經細胞的命運，調節(jié)了神經干細胞的增殖、分化和凋亡[6]。在病理情況下，腦缺血再灌注損傷后Notch通路調節(jié)神經干細胞增殖、分化。Wang L等[7]，研究發(fā)現(xiàn)成年鼠在腦缺血、缺氧后，神經干細胞的增殖過程中，NICD 和 HES1 的表達水平是增高的，阻斷 Notch 通路后，NICD、HES1 的表達減少，同時神經干細胞的增殖也明顯減少。Androutsellis-Theotokis A等[8]，通過滲透泵將Notch 配體 DLL4注入 大鼠 MACO 模型中延遲性激活 Notch 通路的研究發(fā)現(xiàn)，不僅減少了腦缺血再灌注損傷后神經元的死亡，而且促進神經干細胞的新生和缺血后神經功缺損能的恢復。Huang等[9]通過研究發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮可以使局灶性腦缺血再灌注大鼠的 Notch 信號通路激活，進而抑制大腦皮質細胞凋亡。孫芬等[10]研究發(fā)現(xiàn)老年人腦缺血后較正常人腦內Notch1和Jagged1的表達在SVZ區(qū)明顯減少，認為激活 Notch 通路可明顯減少神經元的死亡，同時能夠促進神經干細胞的再生和缺血后神經功能的恢復。袁云等[11]發(fā)現(xiàn)黃芩苷可以明顯減弱體內和被激活小膠質細胞的NF-κB、Notch1、NICD、RBP-JK和Hes-1表達，進而發(fā)揮對缺血后的腦保護作用。有研究者[12]用電針活化Notch信號通路，可促進海馬區(qū)神經干細胞的增殖、遷移和分化，來實現(xiàn)對腦缺血所致神經功能缺損的防治作用。

腦缺血再灌注損傷后，由于腦組織缺血、缺氧使Notch通路被激活，激活的Notch通路不僅通過促進神經干細胞的增殖，使缺血后神經功能缺損得以恢復，而且通過激活Notch通路，促進了缺血區(qū)側支循壞的建立，改善了腦組織的缺血、缺氧狀態(tài)，有效地保護了神經功能的恢復。研究認為[13]，腦缺血再灌注后 Notch 信號通路參與了生理性血管再生，尤其對靜脈和毛細血管的再生發(fā)揮著重要作用。對正常或病變血管，Notch 信號通路均可調節(jié)血管的正常發(fā)育，以及側支循環(huán)的建成。研究表明[14]，運用他汀類藥物治療腦缺血再灌注損傷后，發(fā)現(xiàn)NSCs 以血管為支撐向半暗帶遷移，并能上調缺血半暗帶和腦動脈血管的PS1、Notch1 和 NICD 的表達，從而直接增加動脈管徑和動脈的密度，來促進腦缺血后的血管再生。體外培養(yǎng)研究也發(fā)現(xiàn)[15]，Notch1可通過誘導特定細胞的選擇性分化而促進血管的再生，提示激活的Notch1具有強大的自我更新細胞的作用。

2 Nestin作為腦損傷后神經干細胞增殖特異性標記物的機制探究

巢蛋白(Nestin)表達起始于胚胎早期神經前體細胞，在胚胎腦發(fā)育中呈時空序列性表達，目前主要作為神經干細胞的標記蛋白，應用于神經干細胞的分離、鑒定和培養(yǎng)；Nestin在中樞神經損傷后能重新表達，可作為中樞神經系統(tǒng)損傷的最早、快速應答的敏感指標[16]。

2.1 Nestin概述 Nestin是神經干細胞特異的生物學標記物，是最晚被識別而且是最大的中間絲，其氨基酸殘基數(shù)為1821，相對分子量為240，000，在一級結構中含有307 個氨基酸組成的保守核心區(qū)，其多肽數(shù)為1 條[17]。在1990年Lendahl等[18]發(fā)現(xiàn)及命名了Nestin，他們通過克隆出編碼Rat1401抗原的基因，該基因的結構具有一般中間絲的特征，由該基因編碼的蛋白顯示，其中間段-α螺旋桿結構域的氨基酸序列與已發(fā)現(xiàn)的其它類中間絲蛋16%～29%的同源性。但其基因的內含子位置，蛋白的N 端(頭，較短，只有11 個氨基酸)、C 端(尾，較長，有479個氨基酸，且含有許多帶電荷的氨基酸重復序列)以及在組織細胞的分布等方面均有別于其它五類中間絲蛋白，故被單獨定為第Ⅵ 類中間絲蛋白，并將其命名Nestin。

2.2 Nestin的生理性表達 Nestin 主要位于未分化的、具有分裂能力細胞的細胞質，其表達具有嚴格的時空順序；隨著細胞分化成熟，Nestin 逐漸被膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、神經絲蛋白(NF) 等中間絲蛋白代替而停止表達[19]。在神經干細胞分化早期Nestin 表達仍成陽性，但隨著其分化為神經細胞、星形膠質細胞或少突膠質細胞逐漸發(fā)育成熟，Nestin 的表達逐漸減弱[20]。目前已在胚胎期的放射狀膠質細胞、神經前體細胞、成年神經前體細胞、室管膜細胞、海馬神經元以及損傷誘導成的反應性星形膠質細胞等中樞神經組織中發(fā)現(xiàn)了Nestin的表達[21]。

2.3 病理情況下Nestin的重新表達 近年來研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血、缺氧、創(chuàng)傷以及理化等因素均可誘導Nestin 重新表達：(1)在腦缺血大鼠大腦皮質、室管膜下區(qū)、海馬[22]、缺血中心區(qū)以及周邊區(qū)均有Nestin 的表達并持續(xù)2 w[ 23]。并且有人證實，局灶性腦缺血誘導Nestin 陽性反應以大腦皮質缺血區(qū)及尾殼核較顯著，可持續(xù)到腦缺血后6 w，這些區(qū)域尤其是尾殼核[24]，已經證實對缺血反應敏感；②機械性大腦皮質損傷可誘導傷口周圍的皮質，扣帶回和胼胝體出現(xiàn)大量的Nestin 陽性細胞，而且Nestin 在皮質的表達呈現(xiàn)一個以切口為中心的梯度反應模式，可持續(xù)到術后30 d[25]；(3)一些神經毒性藥物如秋水仙素，可誘導成熟膠質細胞重新表達Nestin；④低蛋白飲食可誘導Nestin 的表達[26]。

腦缺血、缺氧、創(chuàng)傷以及理化等因素均可誘導Nestin 表達上調。有研究表明[27]，大腦中動脈梗死(MCAO)腦組織缺血再灌注6 h 即可見少量Nestin在缺血側室管膜上皮細胞中表達，但著色較淡，室管膜下區(qū)陽性細胞胞核腫脹，突起較短；缺血再灌注12～24 h，Nestin陽性細胞著色較6 h組加深，胞核腫脹、蘇木素著色淺淡、多居邊，數(shù)目逐漸增多，突起亦明顯增長，多指向缺血梗死區(qū)，可見少量纖維狀陽性細胞。側腦室外側壁下方及紋狀體等處尤為明顯；再灌注72 h，Nestin 陽性細胞數(shù)目明顯增多，可見較多沿胼胝體長軸平行排列；至再灌注7 d時，Nestin陽性細胞數(shù)目達到高峰，呈圍繞梗死區(qū)的多層分布，并可見少數(shù)Nestin 陽性細胞突起伸長、交織，但胼胝體處的Nestin陽性細胞已明顯減少；再灌注14 d時Nestin陽性細胞已明顯回落，纖維狀細胞比例較前期有所增加，但仍明顯可見突起較粗、染色較深的肥大型陽性細胞，胼胝體處已幾乎無Nestin陽性膠質細胞存在。觀察在再灌注各時間段對照側室管膜上皮、室管膜下區(qū)( SEZ)、紋狀體、胼胝體等部位亦有Nestin膠質細胞樣表達，隨再灌注時間的延長有增多的趨勢，但數(shù)目較缺血側明顯為少。

3 神經干細胞增殖對腦缺血再灌注損傷后神經功能缺損的修復

傳統(tǒng)觀念認為，成年哺乳動物中樞神經系統(tǒng)中的神經元細胞是終級分化的神經細胞，一旦調亡或壞死，將不可能再生，其功能喪失而無法代償。但Altman在1962年用氚標記胸腺嘧啶核苷酸提供了成年鼠海馬齒狀回產生新神經元的放射自顯影證據，首次發(fā)現(xiàn)腦室下區(qū)域在出生后可產生新的細胞[28]。1992年，Reynolds等報道利用Neurosphere法成功地從成年小鼠腦紋狀體內分離出具有自我更新及分裂増殖能力、并可在特定條件下誘導分化為神經元、星形膠質細胞和小突膠質細胞的神經干細胞[29～31]。這些發(fā)現(xiàn)打破了成年哺乳動物中樞神經系統(tǒng)不能再生這一傳統(tǒng)觀念。隨著分子生物學的逐漸發(fā)展，神經干細胞被成功分離，進一步證實了中樞神經系統(tǒng)中的神經元細胞在一定的條件下可以增殖、分化。在成年哺乳動物中樞神經系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)神經干細胞，不僅是打破了傳統(tǒng)的細胞生理學觀念，更為腦損傷提供了新的治療思路。

目前，在急性缺血性腦損傷的治療中，恢復缺血腦組織的血供及促進神經干細胞增殖、分化是臨床治療的兩個關鍵環(huán)節(jié)?；謴腿毖X組織的血供最有效的方式是溶栓療法。2010版中國急性缺血性腦卒中診治指南明確規(guī)定溶栓的時間窗為不超過4.5或6 h[32]。4.5 h或6 h的時間窗對于腦卒中患者來說是相當短的，有許多患者由于各方面的困難錯過了溶栓的機會。因溶栓的時間窗很窄，溶栓治療在臨床中應用仍然存在很大的局限性，故促進缺血性腦損傷后神經干細胞增殖，從而修復神經功能缺損具有重要的臨床價值。有大量的研究顯示[33～35]，缺血性腦損傷后神經干細胞的增殖與Notch信號轉到通路的激活有關，并證明Notch信號通路在誘導神經前體細胞選擇繼續(xù)增殖或向神經元分化上起著關鍵作用。

4 小結與展望

腦缺血再灌注損傷后，由于腦組織的缺血、缺氧，在進化過程中高度保守的Notch信號轉導通路被激活。通過Notch通路中相關蛋白因子過表達，不僅促進了缺血區(qū)側支循環(huán)的建立、減少了缺血半暗帶神經細胞凋亡，還促進了神經干細胞增殖、分化。故Notch通路的激活有效的促進了腦缺血再灌注損傷后神經功能的恢復。目前，通過神經干細胞培養(yǎng)、分離和鑒定的標記物-Nestin分析檢測腦缺血再灌注損傷后神經干細胞的增殖、遷移、分化。但Nestin在神經干細胞增殖、遷移、分化中的作用機制目前尚不明確；缺血性腦損傷后Notch通路的激活是否是通過作用于Nestin蛋白結構的相應部位促進Nestin的表達仍沒有得到證實。因此，進一步探索作為中樞神經系統(tǒng)損傷的最早、快速應答敏感指標的Nestin的功能及作用機制是十分必要的。通過對Nestin蛋白促進神經干細胞增殖、分化分子生物學機制的進一步研究，必將為將來有可能人為地控制神經干細胞增殖、分化的各項因素，并對其進行定向誘導，從而為神經干細胞的定向誘導分化及臨床應用提供光明的前景。另外，進一步探究Notch信號轉導通路的激活與Nestin過表達的關系具有重要意義。這一關系的探討，可以為藥物通過激活Notch信號通路促進神經干細胞增殖、分化提供分子生物學依據，進而促進新型藥物的誕生，提高臨床療效，也將拓寬腦損傷的治療思路。

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1003-2754(2017)11-1033-03

R743

2017-09-05；

2017-10-15

國家自然科學基金(No. 81560816)

(1.寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004；2.武威市人民醫(yī)院，甘肅 武威 733000；3.寧夏醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，寧夏 銀川 750001)

賈孟輝，E-mail：jjj94330@163.com