楊 斐，趙建寧，徐海棟 （南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，江蘇南京210002）

椎間盤髓核細(xì)胞修飾的相關(guān)研究進(jìn)展

楊 斐，趙建寧，徐海棟 （南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，江蘇南京210002）

椎間盤退變性疾病是臨床常見疾病，目前臨床的治療方法只能解除癥狀，無法從根本上治愈該?。韬私M織工程研究能夠重建髓核組織，修復(fù)和逆轉(zhuǎn)退變椎間盤．在組織工程研究中，同種異體的髓核細(xì)胞常被用作種子細(xì)胞，為了使種子細(xì)胞在移植后獲得更高的活性，更長的存活時間以及更好的功能表達(dá)，要對髓核細(xì)胞進(jìn)行一系列的修飾，主要包括：抗凋亡、調(diào)節(jié)自噬以及永生化修飾．抗凋亡和調(diào)節(jié)自噬的目的都是使種子細(xì)胞在移植后具有較高的活性，能夠長期有效地行使功能，從而保證治療的長期效果．永生化是為了解決髓核細(xì)胞傳代次數(shù)有限，數(shù)量不足的問題．本文主要圍繞以上三個方面展開綜述．

椎間盤；髓核細(xì)胞；細(xì)胞修飾；凋亡；自噬；永生化

0 引言

椎間盤退變性疾病是臨床較為常見的疾病，也是引起腰背部疼痛的主要原因［1］．椎間盤退變從20歲時就可以發(fā)生．不良的生活習(xí)慣、長期的大量載荷通過脊柱、應(yīng)激、遺傳以及抽煙等因素都與該病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2－3］，其臨床表現(xiàn)為頸部、胸部、腰背部的疼痛以及其對應(yīng)神經(jīng)支配區(qū)域出現(xiàn)的運(yùn)動和感覺障礙．其最主要的病理變化為正常椎間盤組織結(jié)構(gòu)的改變．正常的椎間盤組織是由三個部分組成的：終板、纖維環(huán)以及髓核．終板與椎體相連，被一層透明軟骨覆蓋，富含有毛細(xì)血管，為椎間盤提供營養(yǎng)物質(zhì)．纖維環(huán)位于椎間盤外層，由多個薄層纖維組織排列組成，最外層為成纖維細(xì)胞和Ⅰ型膠原纖維，內(nèi)層為類軟骨細(xì)胞和Ⅱ型膠原纖維，纖維環(huán)具有較強(qiáng)的抗拉伸能力，具有維持椎間盤恒定高度的作用．髓核位于椎間盤中央，被纖維環(huán)包繞，呈凝膠狀，含有髓核細(xì)胞，主要包括脊索細(xì)胞和類軟骨細(xì)胞，其基質(zhì)主要包括Ⅱ型膠原及蛋白聚糖等，具有較高的親水性，能夠保證髓核內(nèi)部穩(wěn)定的含水量、滲透壓、pH以及離子濃度，維持正常代謝，同時承載部分椎間盤應(yīng)力，維持椎間盤的形態(tài)和靜水壓力，協(xié)同纖維環(huán)共同實(shí)現(xiàn)生物學(xué)效應(yīng)［4－5］．椎間盤退變發(fā)生的機(jī)制目前還不是很清楚，但是大部分學(xué)者認(rèn)為髓核細(xì)胞退變和凋亡是該病的始動因素．在人體椎間盤發(fā)育過程中，椎間盤的血管網(wǎng)逐漸消失，脊索細(xì)胞逐漸減少，至成人時已無脊索細(xì)胞，主要的髓核細(xì)胞為類軟骨細(xì)胞，它具有合成細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚糖以及Ⅱ型膠原的作用，而細(xì)胞外基質(zhì)蛋白對維持椎間盤正常生理功能至關(guān)重要．正常的椎間盤不含有血管，為低氧環(huán)境．髓核細(xì)胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)、氧以及產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物主要通過擴(kuò)散作用進(jìn)出髓核．隨著長期的應(yīng)力刺激和低氧狀態(tài)下的代謝異常蓄積，髓核細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡、自噬等一系列變化，細(xì)胞活性降低，細(xì)胞外基質(zhì)合成功能減退，細(xì)胞外基質(zhì)代謝異常又進(jìn)一步影響營養(yǎng)物質(zhì)和氧代謝，加劇髓核細(xì)胞外環(huán)境酸化，形成惡性循環(huán)．最終出現(xiàn)纖維環(huán)膠原纖維薄層結(jié)構(gòu)紊亂、裂隙生成，椎間盤生物力學(xué)功能喪失，相應(yīng)的臨床癥狀也逐步出現(xiàn)［6］．

目前對于椎間盤退變性疾病的臨床治療可大致分為保守治療及手術(shù)治療．非手術(shù)治療主要是通過休息或者藥物治療緩解局部炎癥刺激，而手術(shù)治療中無論是脊柱融合手術(shù)還是非融合手術(shù)，也主要是為了緩解臨床癥狀，而非根本性的治療［7］．針對該病的始動因素，逆轉(zhuǎn)髓核細(xì)胞凋亡以及自噬，促進(jìn)髓核細(xì)胞活性以及其功能表達(dá)成為根治椎間盤退變性疾病的主要方向．現(xiàn)階段較多的組織工程研究將同種異體髓核細(xì)胞作為種子細(xì)胞用于研究治療椎間盤退變性疾病，在研究中往往需要對髓核細(xì)胞進(jìn)行一系列修飾，以使其獲得更高的活性，更長的存活時間以及更好的功能表達(dá)［8］．修飾的主要方向大致可以分為三類：抗凋亡、調(diào)節(jié)自噬以及永生化修飾．本文通過對髓核細(xì)胞的抗凋亡、調(diào)節(jié)自噬以及永生化修飾等三方面進(jìn)行綜述，旨在探討：①不同修飾方法所基于的具體機(jī)制是否合理；②運(yùn)用于臨床的可能性；③其臨床治療的真正價值．

1 髓核細(xì)胞抗凋亡修飾

髓核細(xì)胞移植成功的關(guān)鍵在于其抗凋亡能力，即如何保證在已經(jīng)出現(xiàn)椎間盤退變的宿主體內(nèi)實(shí)現(xiàn)大量移植髓核細(xì)胞的長期存活，并實(shí)現(xiàn)其功能表達(dá)．早期的研究著重于提高髓核細(xì)胞的抗凋亡能力．髓核細(xì)胞移植后，在已經(jīng)發(fā)生退變的椎間盤中，移植受體細(xì)胞產(chǎn)生的NO、過氧化物、自由基等因素均可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（ERS），進(jìn)而導(dǎo)致髓核細(xì)胞出現(xiàn)凋亡［9］．真核細(xì)胞的大多數(shù)功能蛋白一般需轉(zhuǎn)位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)進(jìn)行修飾和折疊．氧化應(yīng)激、缺血、鈣穩(wěn)態(tài)的失衡等諸多因素均可影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，導(dǎo)致未折疊或錯誤折疊蛋白的積累，這一過程即稱之為ERS［10］．ERS又可進(jìn)一步激活未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），早期表現(xiàn)為蛋白質(zhì)翻譯和轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制，促進(jìn)分子伴侶的表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解（ERAD），維持ER的正常功能．當(dāng)長期持續(xù)的應(yīng)激或刺激強(qiáng)度超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自身處理能力時，UPR便會啟動細(xì)胞凋亡信號，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生［11］，其中，X盒結(jié)合蛋白1（X?box binding protein 1，XBP1）是ERS反應(yīng)的關(guān)鍵信號調(diào)控因子，XBP1 mRNA經(jīng)過需肌醇酶1（inositol?requiring kinase 1，IRE1）的剪接，由原本具有261個氨基酸的未剪接型 XBP1（X?box binding protein?1 unsplicing，XBP1u）轉(zhuǎn)錄激活成為由376個氨基酸構(gòu)成的剪接型XBP1（X?box binding protein?1 splicing，XBP1s）．XBP1s可調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白的降解和分子伴侶的合成，促進(jìn)髓核細(xì)胞的生存［12］．其具體機(jī)制目前尚未完全闡明，需要更多研究來揭示XBP1在保護(hù)椎間盤髓核細(xì)胞抗凋亡過程中作用的分子機(jī)制及相關(guān)信號通路．

SOX9基因?qū)儆赟OX基因大家族成員之一，是軟骨細(xì)胞合成Ⅱ型膠原過程中重要的因子．在椎間盤退變過程中出現(xiàn)Ⅱ型膠原的減少，其過程與SOX9基因的表達(dá)減少有關(guān)［13］．有學(xué)者通過脂質(zhì)體將SOX9基因和GDF5基因同時轉(zhuǎn)染到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)顯著提高了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核細(xì)胞分化增殖的能力，同時，髓核細(xì)胞獲得了較高的活性和抗凋亡能力［14］．將慢病毒作為載體轉(zhuǎn)染SOX9基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞同樣也能高度表達(dá)Ⅱ型膠原以及蛋白聚糖并向髓核樣細(xì)胞分化，這些實(shí)驗(yàn)充分說明了經(jīng)過SOX9基因修飾的髓核類細(xì)胞具有更完整的細(xì)胞表型，更優(yōu)秀的蛋白合成能力以及更良好的抗凋亡活性，可進(jìn)一步用于椎間盤組織工程的研究當(dāng)中．

PcG蛋白是一種通過染色質(zhì)修飾調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制子的蛋白，具有細(xì)胞記憶功能，可以保證細(xì)胞傳代的穩(wěn)定．CBX8為PcG蛋白的核心組成部分，能夠通過相關(guān)結(jié)合位點(diǎn)以及信號通路如INK4A?ARF通路來調(diào)整細(xì)胞的增殖，延緩細(xì)胞的衰老［15］．同時，也有報道稱CBX8參與了細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)［16］．為了研究CBX8對椎間盤髓核退變的相關(guān)作用機(jī)制，國內(nèi)有學(xué)者干擾髓核細(xì)胞CBX8表達(dá)后發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞增殖能力減弱，細(xì)胞周期進(jìn)程減慢，慧尾實(shí)驗(yàn)證實(shí)當(dāng)CBX8表達(dá)降低后，髓核細(xì)胞的DNA修復(fù)能力將會受到抑制．相反，調(diào)高CBX8表達(dá)后髓核細(xì)胞活性升高，增殖相對活躍，多次傳代培養(yǎng)后表型保持相對完整，可作為髓核組織工程種子細(xì)胞的選擇［17］．

在椎間盤退變過程中，TGF?β1在早期能夠促進(jìn)髓核細(xì)胞外基質(zhì)的生成，減慢退變發(fā)生的速度，然而隨著成纖維細(xì)胞不斷增多取代髓核細(xì)胞，在TGF?β1作用下合成Ⅰ型以及Ⅲ型膠原，Ⅱ型膠原合成減少，髓核生理結(jié)構(gòu)破壞，退變加速，最終導(dǎo)致整個椎間盤纖維環(huán)失去原有力學(xué)性質(zhì)［18］．TGF?β3在TGF?β家族中屬于正向調(diào)節(jié)因子，在降低TGF?β1表達(dá)的同時能夠促進(jìn)Ⅱ型膠原的合成［19］．腺病毒載體技術(shù)能夠?qū)GF?β3轉(zhuǎn)染至退變的髓核細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性得到明顯改善，Ⅱ型膠原及蛋白聚糖表達(dá)升高，在進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)中，TGF?β3轉(zhuǎn)染修飾的髓核細(xì)胞被移植到新西蘭兔退變動物模型中，14周后組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)缺損的椎間盤部分得到新生髓核的填充，髓核細(xì)胞數(shù)目增多，Ⅱ型膠原和蛋白聚糖增多，并且使用該種方法轉(zhuǎn)染的髓核細(xì)胞，其目的基因可保持穩(wěn)定表達(dá)的時間長達(dá)3個月，可以有效運(yùn)用于組織工程研究［20］．

2 髓核細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)

凋亡和自噬是細(xì)胞程序性死亡的兩種形式．繼抗凋亡研究之后，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)自噬對調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞程序性死亡也同樣重要．與凋亡相比，自噬不出現(xiàn)凋亡所特有的凋亡小體以及核固縮現(xiàn)象，但會在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)形成自噬體．在正常情況下，自噬對細(xì)胞是有利的，能夠促進(jìn)細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的存活，清除細(xì)胞內(nèi)由應(yīng)激產(chǎn)生的氧自由基、錯誤折疊蛋白等．但是過度自噬將會超出細(xì)胞的代償能力，溶酶體將無法降解全部自噬體，由此誘發(fā)細(xì)胞Ⅱ型程序性死亡或者觸發(fā)細(xì)胞凋亡最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［21］髓核細(xì)胞處在缺血、缺氧的椎間盤環(huán)境中，同樣也存在著自噬現(xiàn)象，而且其水平會隨著年齡的增長以及退變程度的加重而不斷地提高［22］．有研究發(fā)現(xiàn)自噬對于髓核細(xì)胞有兩方面的作用：一方面在正常椎間盤組織中，自噬能夠保證髓核細(xì)胞在低血供、低氧狀態(tài)下的穩(wěn)定，而發(fā)生重度椎間盤退變的動物模型中，其自噬水平要明顯低于正常，相反凋亡水平明顯升高．另一方面，在椎間盤退變早期，由于代償作用使自噬水平明顯升高，超過溶酶體代償能力，過度自噬導(dǎo)致了髓核細(xì)胞的死亡［23］．因此，針對組織工程中髓核細(xì)胞自噬水平的調(diào)控應(yīng)該以維持其平衡為目標(biāo)，既要保證一定的自噬水平以維持細(xì)胞的穩(wěn)定，同時又要避免自噬過度對細(xì)胞產(chǎn)生損傷．目前髓核細(xì)胞自噬水平的調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚，有研究［24］發(fā)現(xiàn)在通過血清剝奪誘導(dǎo)SD大鼠椎間盤細(xì)胞發(fā)生自噬后，IL?1β能促進(jìn)其自噬水平進(jìn)一步的升高．椎間盤本身存在的低氧環(huán)境對自噬也具有重要的調(diào)節(jié)作用，髓核細(xì)胞在低氧環(huán)境中能夠通過下調(diào)ROS來避免過度自噬，促進(jìn)其在血清剝離下的存活［25］．因此，在髓核組織工程構(gòu)建中，應(yīng)盡可能保證髓核細(xì)胞處于相對低氧環(huán)境．

3 椎間盤髓核細(xì)胞永生化

目前，隨著基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的不斷發(fā)展，髓核細(xì)胞永生化的構(gòu)建成為了新的研究方向．正常細(xì)胞在體外經(jīng)過有限次數(shù)的傳代后便會衰老死亡，髓核細(xì)胞在體外培養(yǎng)傳代時間平均為21 d，經(jīng)過10次左右傳代后便停止增殖．在組織工程研究中，為了獲得更多的髓核細(xì)胞資源，往往會對種子細(xì)胞進(jìn)行永生化修飾．細(xì)胞永生化是指細(xì)胞在一定條件干預(yù)下逃離增殖衰老危機(jī)，獲得無限增殖能力的過程，但人類細(xì)胞很少會出現(xiàn)自發(fā)永生化［26］．研究中，可以將永生化基因通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入髓核細(xì)胞，建立永生化髓核細(xì)胞株，從而獲得豐富的種子細(xì)胞來源．現(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)，永生化的發(fā)生主要與細(xì)胞端粒以及端粒酶有關(guān)．因此，針對髓核細(xì)胞永生化的修飾，主要是通過修飾端粒以及端粒酶來完成．端粒的長度決定了細(xì)胞的有絲分裂次數(shù)，而端粒酶能夠維持端粒長度的恒定［27］．因此，通過活化端粒酶，提高其表達(dá)可以誘導(dǎo)髓核細(xì)胞發(fā)生永生化．有學(xué)者運(yùn)用人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞，成功地構(gòu)建了永生化髓核細(xì)胞，并且在構(gòu)建的永生化髓核細(xì)胞中加入重組綠色熒光蛋白示蹤，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，同時永生化髓核細(xì)胞的表型及活性在多次傳代后能夠保持穩(wěn)定，該技術(shù)能夠?yàn)樗韬私M織工程的研究提供豐富的種子細(xì)胞［28］．

髓核細(xì)胞修飾的發(fā)展大致經(jīng)歷了抗凋亡、自噬調(diào)節(jié)以及目前的永生化這一系列過程．三者之間也存在著緊密聯(lián)系．①三類修飾方法中抗凋亡修飾最早出現(xiàn)，也是基礎(chǔ)，自噬調(diào)節(jié)是對抗凋亡修飾的補(bǔ)充，永生化研究則是目前的新的研究方向；②三者的目的都是為了提高髓核細(xì)胞在移植后的細(xì)胞活性；③三者基于不同的機(jī)制，存在各自的優(yōu)點(diǎn)和缺陷，聯(lián)合運(yùn)用相關(guān)方法或許能夠達(dá)到更好的效果．

4 總結(jié)與展望

髓核組織工程研究對于治療椎間盤退變性疾病是一種新的思路，能夠從根本上修復(fù)甚至逆轉(zhuǎn)退變過程．它主要包含三個要素：種子細(xì)胞，細(xì)胞支架以及生長因子．其中，種子細(xì)胞是整個組織工程研究中最重要的對象，如何能夠獲得大量表型穩(wěn)定，功能和活性良好的種子細(xì)胞一直是組織工程研究的問題．同種異體的髓核細(xì)胞因?yàn)槠洳恍枰T導(dǎo)分化，適應(yīng)低氧環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)被用作種子細(xì)胞，為了保證移植后的活性和功能，髓核細(xì)胞需要進(jìn)一步修飾．抗凋亡和調(diào)節(jié)自噬的目的都是使種子細(xì)胞在移植后具有較高的存活率，能夠長期有效地行使功能，從而保證治療的長期效果．永生化則是為了解決髓核細(xì)胞傳代次數(shù)有限，數(shù)量不足的問題，組織工程治療椎間盤退變需要運(yùn)用大量種子細(xì)胞，只有在保證充足的髓核細(xì)胞數(shù)量前提下，才能實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的研究和治療．在解決了以上問題后，髓核組織工程治療椎間盤退變性疾病才能最終實(shí)現(xiàn)臨床運(yùn)用．

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Advances in research of nucleus pulposus cell modification in intervertebral discs

YANG Fei，ZHAO Jian?Ning，XU Hai?Dong
Nanjing General Hospital of PLA，Nanjing 210002，China

Degenerative disc disease is a common clinical dis?ease．The current clinical treatment can only relieve symptoms．However，nucleus pulposus tissue engineering can reconstruct the nucleus pulposus，repair and reverse degenerative disc．In tissue engineering studies，allogeneic nucleus pulposus cells are often used as seed cells．In order to make seed cells obtain higher viability，longer survival time and better functional expression after transplantation，a series of modifications have to be applied to nucleus pulposus cells，including：anti?apoptosis，regulation of autophagy and cellular immortality．The purpose of anti?apoptosis and autophagy regulation is to make seed cells have high viability after transplantation，and to ensure the long?term effect of treat?ment．Cellular immortality can solve the problem of limited pas?sage number and insufficient cell resources．This article mainly focuses on the above three aspects．

intervertebral disc；nucleus pulposus cells；cell modification；apoptosis；autophagy；immortalization

R681．5

A

2095?6894（2017）02?53?04

2016－12－27；接受日期：2017－01－12

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81501925）

楊 斐．E?mail：1415619503＠qq．com

徐海棟．博士，副主任醫(yī)師．研究方向：脊柱外科、骨科基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化．E?mail：xuhaidong1980＠163．com