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(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

·小專(zhuān)論·

組織芯片技術(shù)在消化道腫瘤研究中的應(yīng)用

付實(shí)，張琍*

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

組織芯片是一種高密度的組織微點(diǎn)陣，它能高度集中多種不同類(lèi)型的組織標(biāo)本，從而一次性完成大樣本指標(biāo)篩選工作。相比于傳統(tǒng)的石蠟切片，組織芯片有著更高的效率，在腫瘤學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用。本文根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究成果，就組織芯片技術(shù)的概念、分類(lèi)及其在消化道腫瘤研究中的應(yīng)用進(jìn)展等方面予以綜述。

組織芯片技術(shù)； 生物芯片； 消化道腫瘤

生物芯片技術(shù)起源于核酸雜交理論，隨著20世紀(jì)90年代的人類(lèi)基因組計(jì)劃和分子生物等相關(guān)學(xué)科的進(jìn)展，生物芯片技術(shù)也得到了迅猛的發(fā)展。它將大量生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)相關(guān)的材料整齊有序的集成在玻片等固像載體上而形成的可與目的靶分子互相作用、并行反應(yīng)的固相表面。根據(jù)固定在載體上的物質(zhì)成分可分為基因芯片、組織芯片、蛋白質(zhì)芯片等，這些高通量的篩選技術(shù)從根本上改變了生物醫(yī)學(xué)的研究。組織芯片自提出以來(lái)，以其高通量、平行性、節(jié)省性等優(yōu)點(diǎn)迅速引起了廣大關(guān)注，它可以研究特定基因及其表達(dá)產(chǎn)物與疾病的相關(guān)性,在腫瘤分子病理研究上極具潛力和價(jià)值，它已成為解剖病理學(xué)家在腫瘤研究中最具前途的工具之一。

1 組織芯片的概念及分類(lèi)

組織芯片也稱(chēng)組織微陣列(tissue microarray,TMA),它的物質(zhì)成分為標(biāo)本組織，研究者可通過(guò)免疫組化、熒光原位雜交、原位PCR等方法，對(duì)組織中特異性的靶點(diǎn)進(jìn)行高通量的分析。它可以同時(shí)在DNA、RNA及蛋白水平上對(duì)大量標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)分析，TMA可以通過(guò)成百上千的標(biāo)本對(duì)某一特定的基因進(jìn)行分析，這與基因芯片有所區(qū)別,基因芯片一般是從單一的組織或者細(xì)胞系中對(duì)成百上千的基因進(jìn)行分析[1]。

按照TMA樣本含量的大小可分為低密度芯片(小于200個(gè)點(diǎn))，中密度芯片(200～600個(gè)點(diǎn))，高密度芯片(大于600個(gè)點(diǎn))。按照組織來(lái)源分為人類(lèi)、動(dòng)物、植物三大類(lèi)芯片，而人類(lèi)組織芯片又可分為正常組織芯片、疾病組織芯片、胚胎組織芯片。人類(lèi)腫瘤組織芯片屬于人類(lèi)疾病組織芯片中的一種。腫瘤組織芯片又可分為多腫瘤組織芯片、腫瘤進(jìn)展(演進(jìn))芯片和預(yù)后組織芯片。多腫瘤芯片是包含多種腫瘤類(lèi)型的芯片，可以用它來(lái)篩選出不同腫瘤類(lèi)型中的分子差異，腫瘤進(jìn)展(演進(jìn))芯片可以研究某一特定腫瘤不同階段的分子改變，預(yù)后芯片包含可用的臨床隨訪資料的腫瘤樣本，可以用其檢測(cè)腫瘤預(yù)后分子的變化，從而了解該因子與腫瘤預(yù)后的關(guān)系。

2 組織芯片技術(shù)在消化道腫瘤中的應(yīng)用

從目前國(guó)內(nèi)外的資料來(lái)看，組織芯片在腫瘤研究中得到廣泛的應(yīng)用，包括對(duì)前列腺癌、陰莖癌、平滑肌肉瘤等[2-4]。在腫瘤中的應(yīng)用主要是腫瘤標(biāo)記物的篩選、腫瘤中免疫表型的相關(guān)研究、腫瘤病因?qū)W、與基因芯片聯(lián)合檢測(cè)[5]。

2.1肝癌肝癌是少數(shù)幾種可以直接由病毒誘發(fā)的腫瘤之一，目前乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)是肝癌的首要誘因。組織芯片聯(lián)合基因芯片技術(shù)可以更好的來(lái)研究肝癌與HBV之間的聯(lián)系。Ma等[6]注意到羧酸末端截?cái)嗟腍BX(HBV的產(chǎn)物)時(shí)常在肝癌中出現(xiàn)，羧基末端截?cái)嘈虷Bx即3’端的X基因的缺失的HBx，完整的HBx包含HBx-Ab1和HBx-Ab2，而截?cái)嘈虷Bx只能由HBx-Ab1來(lái)認(rèn)定，為了驗(yàn)證羧基末端截?cái)嘈虷Bx在肝癌中起關(guān)鍵作用，Ma團(tuán)隊(duì)利用組織芯片聯(lián)合基因芯片技術(shù)對(duì)肝癌中的HBx進(jìn)行了檢測(cè)，組織芯片結(jié)果顯示羧基末端截?cái)嘈虷Bx在HCC有79.3%的表達(dá)?；蛐酒Y(jié)果顯示HepG2-X1(與截?cái)嘈虷Bx有關(guān))具有促進(jìn)增殖、抗凋亡的效果，最后得出羧基截?cái)嗟腍Bx蛋白在肝癌的發(fā)生中起著重要的作用的結(jié)論。Ma等分別用PCR、RNA印記雜交對(duì)組織芯片、基因芯片的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果證明了組織芯片及基因芯片的可靠性。組織芯片還可以研究罕見(jiàn)的肝癌類(lèi)型，Riehle等[7]利用包含正常肝組織，肝癌、肝纖維板層型癌，膽管癌、肝局灶性結(jié)節(jié)性增生等組織的組織芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mTORC1和FGFR1與纖維板層肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。

2.2胃癌胃癌是中國(guó)排名第三的癌癥死亡原因，每年約有70余萬(wàn)人死于胃癌[8]。胃癌的發(fā)生通常與多種環(huán)境因素及遺傳因素有關(guān)。研究胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制對(duì)胃癌的診治起到至關(guān)重要的作用。吳勇軍，等[9]用含152例胃癌、上皮內(nèi)瘤變48例及正常胃粘膜60例構(gòu)成的進(jìn)展組織芯片來(lái)驗(yàn)證胃癌中Cofilin1表達(dá)及其意義，結(jié)果表明Cofilin1在正常胃黏膜組織、上皮內(nèi)瘤變組織、胃癌中表達(dá)分別為36.67%、66.67%、78.95%，它與胃癌腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)，且與胃癌進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)，它們可能是胃癌侵襲轉(zhuǎn)移重要的生物標(biāo)記物。

胃癌的分子靶向治療逐漸走向臨床應(yīng)用，曲妥珠單抗是針對(duì)Her2因子原癌基因產(chǎn)物的單克隆抗體，與Her2結(jié)合后可間接發(fā)揮抗腫瘤作用，現(xiàn)已應(yīng)用于乳腺癌中Her2表達(dá)陽(yáng)性的患者。為了驗(yàn)證Her2在胃癌中表達(dá)，Grabsch等[10]構(gòu)建了含高密度的胃癌標(biāo)本(單位面積中腫瘤含量大于50%)、低密度的胃癌標(biāo)本(單位面積中腫瘤含量小于50%)的組織芯片，并用非腫瘤性胃粘膜標(biāo)本作為對(duì)照，結(jié)果表明Her2在非腫瘤胃粘膜表達(dá)陰性，且只在腸型胃癌的一小部分亞型中表達(dá)，Her2在胃癌中的表達(dá)存在明顯的異質(zhì)性，故今后對(duì)于有相同的形態(tài)學(xué)表型而有不同的分子表型的胃癌患者可能需要不同的治療策略，此研究為曲妥珠單抗治療Her2陽(yáng)性胃癌提供了依據(jù)。

2.3食管癌食管癌的發(fā)病率雖沒(méi)有胃癌高，但5年生存率仍較低。值得慶幸的是近年來(lái)食管癌患者5年生存率逐年提高[11]。組織芯片在食管癌中也同樣應(yīng)用廣泛，可以檢測(cè)食管癌B7-H1可以作為其預(yù)后因子[12]、食管癌中存在上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等[13]。組織芯片技術(shù)是可靠的，Li等[14]用組織芯片采用RNA原位雜交的方法研究miR-375在食管癌及正常食管粘膜之間的聯(lián)系及臨床意義，同時(shí)他的團(tuán)隊(duì)為了驗(yàn)證組織芯片所得結(jié)果的可信度，又利用qRT-PCR的方法進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果跟RNA原位雜交的基本一致。這些都證明了組織芯片在食管癌檢測(cè)中的實(shí)用性及可靠性。

2.4大腸癌大腸癌最容易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，可以用組織芯片研究大腸癌轉(zhuǎn)移瘤的情況，Katz等[15]利用188例直腸癌肝轉(zhuǎn)移術(shù)后患者的標(biāo)本及預(yù)后信息制作了預(yù)后組織芯片，用來(lái)研究腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(CD3、CD4、CD8及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)計(jì)數(shù)與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示含有大量調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的患者預(yù)后差，這可能與免疫抑制有關(guān)，而腫瘤的免疫反應(yīng)可以作為大腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)。組織芯片還可以與其他技術(shù)聯(lián)合運(yùn)用，來(lái)篩選與大腸癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物，Kume等[16]做了迄今為止規(guī)模最大的生物標(biāo)志物膜蛋白驗(yàn)證研究，首先對(duì)來(lái)源于大腸癌及息肉中的5566種蛋白進(jìn)行篩選，利用去細(xì)胞成分分析、TMHMM算法、質(zhì)譜選擇反應(yīng)(多反應(yīng))檢測(cè)技術(shù)等多項(xiàng)方法，篩選出ITGA5、GPRC5A、PDGFRB、TFRC等這些已經(jīng)證實(shí)與大腸癌相關(guān)的蛋白，同時(shí)也篩選出C8orf55這個(gè)功能尚不明確蛋白，Kume團(tuán)隊(duì)又利用包含14種常見(jiàn)腫瘤及13種正常組織做成的組織芯片了解該蛋白在不同組織表達(dá)情況，結(jié)果顯示C8orf55在結(jié)腸癌中相比正常結(jié)腸組織有更高的表達(dá)，C8orf55可能是結(jié)腸癌的生物標(biāo)志物。

2.5胰腺癌相比大腸癌，胰腺癌預(yù)后差，病死率高，具有“難發(fā)現(xiàn)、易轉(zhuǎn)移、難治療”這三大特點(diǎn)，有“癌中之王”之稱(chēng)，所以做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷至關(guān)重要。Wen等[17]首先利用人胰腺癌組織芯片對(duì)Oct4和NanogOct4進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示Oct4和NanogOct4均在化生管中有強(qiáng)表達(dá)，隨后又用金黃地鼠胰腺癌模型進(jìn)行了驗(yàn)證，分別于第15、19、24周處死地鼠獲得相應(yīng)組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示第15周可檢測(cè)到化生管，第24周的組織出現(xiàn)胰導(dǎo)管內(nèi)癌，而化生管中Oct4強(qiáng)表達(dá)(因沒(méi)有免疫反應(yīng)性，地鼠組織中NanogOct4無(wú)法評(píng)價(jià))，在腫瘤的早期出現(xiàn)上述因子，考慮Oct4、NanogOct4可能與胰腺癌的早期發(fā)生密切相關(guān)。篩選與預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物也很重要，能為靶向治療提供依據(jù)。Winter等[18]利用預(yù)后組織芯片將多個(gè)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明，相比其他標(biāo)志物，MUC1、間皮素能更好的了解胰腺癌預(yù)后。miRNA是內(nèi)源性非編碼RNA分子，與胰腺癌的診斷、治療效果、預(yù)后密切相關(guān)。楊珂[19]就采用原位雜交、免疫組化的方法檢測(cè)106例胰腺癌組織芯片中miR-150及其靶蛋白c-Myb、MUC4在胰腺癌中的表達(dá)情況，得出miR-150及其靶蛋白與胰腺癌預(yù)后相關(guān)的結(jié)論。

3 TMA的缺點(diǎn)

組織芯片優(yōu)點(diǎn)眾多，同時(shí)它也有自身的不足。例如因?yàn)槟[瘤的異質(zhì)性，所取樣本并不一定能代表腫瘤組織，制備的過(guò)程需要專(zhuān)業(yè)的人員和設(shè)備，制作成本較大，存在抗原變化等問(wèn)題[20]。同時(shí)也存在組織芯片的制作尚不能自動(dòng)化，標(biāo)本脫片、移位及相應(yīng)的讀片及信息處理系統(tǒng)不完備等問(wèn)題。

4 應(yīng)用前景

組織芯片以其高通量、節(jié)省性等優(yōu)點(diǎn)在腫瘤中的應(yīng)用非常廣泛，使得分子病理學(xué)的研究取得了重大發(fā)展。它仍有許多潛在的應(yīng)用，當(dāng)前組織芯片絕大多數(shù)都應(yīng)用于腫瘤研究，相信以后也可更多的應(yīng)用于炎癥、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等非腫瘤疾病方向。組織芯片還可運(yùn)用于轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物，以研究特定基因表達(dá)，為疾病的靶向治療提供依據(jù)。未來(lái)的組織芯片所包含的樣本可以更大，將有利于疾病的大數(shù)據(jù)研究。雖然組織芯片實(shí)現(xiàn)了小型化，但讀片與大數(shù)據(jù)的分析仍需要耗費(fèi)大量時(shí)間，相信以后隨著與之配套的讀片與分析儀器設(shè)備的出現(xiàn)，其必將發(fā)揮更大的效能和作用。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.019

2016-07-14；

2017-01-16

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81372378)

*通訊作者，E-mail:hyzhanglig@163.com.

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