謝 正，毛建文

（廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系，廣東 廣州 510006）

燙傷是日常生活中一種常見的意外傷害，通常是由于不下心接觸滾燙的液體或金屬所致。尤其是兒童的安全意識較低，更容易接觸一些高溫物體。燙傷過后如果不及時(shí)處理燙傷傷口，就很有可能引起皮膚壞死，留下后遺癥。燙傷后形成的硬痂不僅影響活動和外觀，嚴(yán)重時(shí)甚至可以導(dǎo)致殘疾[1]。

燙傷后，皮膚內(nèi)部毛細(xì)血管破裂，出現(xiàn)紅腫，組織液滲出形成水泡[2]。外泌體因?yàn)榇嬖谟谘汉徒M織液中，所以可以直接接觸燙傷部位。外泌體是一種直徑為40-100nm的納米級雙分子層囊泡，外泌體由細(xì)胞分泌釋放出來，在血液等體液內(nèi)傳播，幾乎分布于全身各處[3]。外泌體通過攜帶mRNA，MicroRNA和蛋白質(zhì)等生物活性分子從而介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，從而發(fā)揮多種功能[4-5]。血清是血液的主要成分之一，血清中含有大量的外泌體，而血清中外泌體在燙傷修復(fù)中的作用尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究探討了血清外泌體在小鼠燙傷愈合中的作用及其機(jī)理，為燙傷的修復(fù)治療提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 血清外泌體的提取及鑒定

抽取小鼠血液，靜置1 h，離心2000 g，15 min后分離血清。離心2000 g，30 min去除細(xì)胞碎片，轉(zhuǎn)移至新離心管中，每管分裝1 mL血清。按賽默飛公司外泌體提取試劑盒說明書上的步驟提取外泌體。電子透射顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)特征。Western blot檢測外泌體的特異性蛋白CD63和HSP70的表達(dá)。提取外泌體后，用BCA法測蛋白樣品的濃度后計(jì)算蛋白上樣量，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，TBS/T洗三次，用脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBS/T洗三次后加入一抗（CD63，1：1000；HSP70，1：1000），冰箱4 ℃孵育過夜?；厥找豢购?，TBS/T洗三次，加入相對應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h。TBS/T洗三次，顯影、定影。

1.2 小鼠深I(lǐng)I度皮膚燙傷模型的建立及血清外泌體的治療

將體質(zhì)量為18～22 g的小鼠用10%水合氯醛麻醉后進(jìn)行背部脫毛和皮膚消毒處理，隨后將小鼠背部貼放在燙傷裝置上進(jìn)行造模。燙傷裝置由水浴鍋和隔熱木板組成，隔熱木板上設(shè)有孔徑為6 mm的圓洞。燙傷溫度和時(shí)間后最終確定水浴鍋溫度設(shè)置為85℃，燙傷時(shí)間為8秒。在每只小鼠背部兩側(cè)各燙出一個(gè)直徑為6 mm的圓形創(chuàng)面，隨后在小鼠其中一側(cè)燙傷部位周邊注射100 μL PBS重懸的外泌體，另一側(cè)燙傷部位注射等量PBS，形成自身對照。每只小鼠造模后均單籠飼養(yǎng)。定期觀察小鼠燙傷創(chuàng)面愈合情況。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)

將處在對數(shù)生長期的小鼠成纖維細(xì)胞以1.5×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液。設(shè)4組，每組3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞完全貼壁后吸棄培養(yǎng)液，PBS洗3次。每孔加入100 μL DMEM培養(yǎng)基。隨后加入3種不同濃度的外泌體懸液，空白組加等量PBS。培養(yǎng)24h后，每孔加入MTT 20 μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min后用酶標(biāo)儀檢測吸光值。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將處于對數(shù)生長期的表皮細(xì)胞Hacat以25×104個(gè)/mL的密度接種于12孔板，每孔1 mL細(xì)胞懸液。設(shè)2組，每組3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，用200 μL槍頭在每孔底部中間劃一道細(xì)線，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗3次。每孔加入1mL DMEM培養(yǎng)基，隨后兩組分別加入外泌體懸液和等量PBS。培養(yǎng)24 h后，在顯微鏡下拍攝細(xì)胞遷移情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%），例（n）表示，采用x2檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外泌體的形態(tài)與鑒定

血清外泌體在電鏡下的形態(tài)為雙分子層圓形結(jié)構(gòu)。Western bolt結(jié)果顯示，外泌體試劑盒提取的血清外泌體可以檢測出特異性標(biāo)記蛋白CD63和HSP70。

2.2 血清外泌體促進(jìn)小鼠燙傷皮膚創(chuàng)面的愈合

動物整體實(shí)驗(yàn)顯示，相對于空白對照，血清外泌體能顯著促進(jìn)小鼠深二度燙傷創(chuàng)面愈合，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間。

2.3 血清外泌體對成纖維細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示：不同劑量的血清外泌體作用24 h后，可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，呈現(xiàn)劑量依賴性。PBS、2 ul Exo、5 ul Exo、10 ul Exo組24 h的OD值分別為（0.630±0.118）、（0.774±0.098）、（1.060±0.087）、（1.174±0.089）。

10 ul/孔濃度的外泌體也呈時(shí)間依賴性地促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。10 ul Exo組的OD值在0、1、2、3天分別為（0.563±0.084）、（1.110±0.159）、（1.364±0.208）、（1.408±0.159），PBS組的OD值在0、1、2、3 天分別為（0.571±0.076）、（0.731±0.113）、（1.044±0.152）、（1.121±0.136）。

2.4 血清外泌體對表皮Hacat細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示：血清外泌體可以顯著地促進(jìn)Hacat細(xì)胞的遷移，外泌體組和PBS組在24 h的遷移率分別為（64.55±4.85）、（33.25±5.35）。外泌體組與PBS處理組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P＜0.01）。

3 討 論

雖然外泌體早在在1983年就被發(fā)現(xiàn)[6]，但一直未受到人們的重視。然而通過近幾年的研究，人們發(fā)現(xiàn)了外泌體在免疫中抗原呈遞[7]、腫瘤的生長與遷移[8]、組織損傷的修復(fù)[9]等多個(gè)領(lǐng)域的作用。

在燙傷的修復(fù)過程中，燙傷的皮膚組織和細(xì)胞通常不能靠原來性質(zhì)的細(xì)胞修復(fù)，而是由成纖維細(xì)胞增生來填補(bǔ)受損的組織，成纖維細(xì)胞的增殖對愈合速率有較大的影響。成纖維細(xì)胞通過大量增殖，合成和分泌的膠原纖維和基質(zhì)成分，與新生毛細(xì)血管等共同形成肉芽組織，填補(bǔ)缺損壞死組織，為表皮細(xì)胞的覆蓋創(chuàng)造條件[10-11]。在燙傷修復(fù)的最終階段，隨著硬痂的脫落，表皮細(xì)胞的遷移完成覆蓋。

我們的結(jié)果證實(shí)了血清外泌體能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，并能顯示出量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系，并且本實(shí)驗(yàn)也顯示血清外泌體能促進(jìn)Hacat細(xì)胞的遷移。然而，血清外泌體促進(jìn)纖維細(xì)胞增殖和表皮細(xì)胞遷移的機(jī)制目前尚未明確，值得進(jìn)一步的深入探討。本研究采用的是皮下注射給藥，相對于涂抹的給藥方式，不受皮膚通透性的影響。血清外泌體源于血液，相對于傳統(tǒng)燙傷中成藥而言，刺激性小，生物親和性高，不會加重傷口的不適。我們的研究也顯示血清外泌體對燙傷小鼠有較好的療效的同時(shí)沒有出現(xiàn)紅腫等排斥現(xiàn)象。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)血清外泌體能促進(jìn)小鼠燙傷創(chuàng)面的愈合，為臨床皮膚燙傷的治療提供了新的思路。

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