張祖勇 程洪強 董曉巧 王昊 張仕蓉

腦膠質瘤小鼠模型構建研究進展

張祖勇 程洪強 董曉巧 王昊 張仕蓉

腦膠質瘤（glioma）是一種常見的腦腫瘤，根據(jù)細胞形態(tài)等組織學特征，可以分成Ⅳ級，其中Ⅰ、Ⅱ級為進展慢，惡性程度低的低級別膠質瘤；而Ⅲ、Ⅳ級為惡性程度高的高級別腫瘤，包括最常見的多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）。膠質母細胞瘤惡性程度高，患者生存時間短，1年生存率＜50%，5年生存率＜5%［1］。世界衛(wèi)生組織建議根據(jù)基因突變的分子病理特征對膠質瘤進行分型，指導患者的管理和藥物使用［2-4］。目前對膠質瘤的治療方法主要是手術切除，輔助以術后放化療。由于膠質瘤的高度侵襲性無法完全去除腫瘤細胞。血腦屏障的存在降低化療藥物治療效果，膠質瘤患者術后易復發(fā)［1］。對膠質瘤發(fā)生的分子與細胞水平的認識及新型治療藥物的研發(fā)均需要模式生物［5］。本文對膠質瘤研究中的小鼠模型進行綜述。

1 化學誘變

上世紀70年代用致癌劑誘導動物產生彌漫性膠質瘤是早期廣泛使用的膠質瘤動物模型。孕鼠尾靜脈注射亞硝基硫脲（N-ethyl-N-Nitrosourea，NEU）導致多數(shù)宮內暴露致癌劑仔鼠發(fā)生膠質瘤（成年動物注射致癌劑不能產生腦瘤）［6］。對化學誘變產生的膠質瘤進行基因變異分析，發(fā)現(xiàn)存在與臨床一致的p53突變和PDGFR/EGFR基因拷貝數(shù)增加等基因變異［7］?；瘜W誘導產生的膠質瘤較好模擬了臨床上膠質瘤的遺傳異質性，同時保全小鼠的免疫系統(tǒng)和血腦屏障。然而由于基因突變的隨機性導致膠質瘤生成重復性差（如腫瘤發(fā)生率，惡性程度，腫瘤類型與位置等）不足，現(xiàn)已較少使用這種小鼠模型研究膠質瘤。

現(xiàn)在普遍使用的膠質瘤細胞株，如9L，C6，GL261及CNS-1等，來自化學誘導的大鼠或小鼠膠質瘤模型［8］。C6細胞株來自甲基硫脲處理的大鼠，組化與腫瘤標志物與人膠質母細胞瘤相似，但無抑癌基因p53的變異。CNS-1同樣是大鼠膠質瘤細胞株，表達膠質瘤標志物，比如GFAP，S100β等，及表現(xiàn)出人膠質瘤的典型特征彌漫性和浸潤性生長。9L和GL261來自小鼠的膠質瘤細胞株，前者有p53突變和EGFR過表達，但不表達GFAP，也不表現(xiàn)為彌漫性侵入式生長，因此認為其為膠質肉瘤。GL261表現(xiàn)為低分化的膠質母細胞瘤。具有p53和K-ras 基因突變及PI3K/AKT活化等特征。這些細胞株不僅普遍應用于膠質瘤的分子細胞生物學研究，也是異種細胞移植模型中普遍使用的細胞來源。

2 異種細胞移植

將腫瘤細胞注射入小鼠皮下（異位）或顱腔內（原位）可以形成異位或原位膠質瘤［9］。腫瘤細胞可以是來自化學誘變的膠質瘤動物的腫瘤細胞系，也可以是膠質瘤患者來源的腫瘤細胞。皮下異位移植操作簡單，重復性好，易觀察腫瘤生長的動態(tài)過程，適合研究腫瘤細胞的增殖行為。異位細胞移植失去腦部的環(huán)境特征，限制其在藥物研發(fā)中的作用，尤其是針對腫瘤微環(huán)境的藥物研發(fā)。原位膠質瘤細胞移植模型能較好的規(guī)避腫瘤微環(huán)境問題。異種移植的另外一個缺陷是使用免疫缺陷的小鼠，阻礙對腫瘤與免疫系統(tǒng)相互作用的研究。人源化小鼠的研發(fā)與使用可以讓異種細胞移植模型更好的服務于腫瘤的基礎與藥物開發(fā)研究。該小鼠模型在膠質瘤基礎研究中廣泛使用，檢測或篩選新的基因或信號通路在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的作用［10-11］。

3 轉基因小鼠模型

小鼠與人在遺傳與生理上存在多方面相似性，這是小鼠成為主要模式動物的原因。隨著技術的進步，現(xiàn)在可以在分子水平操作小鼠的基因組，包括不可傳代的體細胞轉染和可傳代的穩(wěn)定遺傳修飾。研究發(fā)現(xiàn)RTK/PI3K、p53和Rb信號異常是膠質瘤發(fā)生與惡性進展的核心通路，因此膠質瘤小鼠模型主要是回繞這些核心通路構建的。

3.1 IDH1R132H突變條件性敲入小鼠模型 異檸檬酸脫氫酶IDH是三羧酸循環(huán)中一個關鍵限速酶，包括IDH1、IDH2和IDH3三個亞型，催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸。人膠質瘤中存在IDH1突變，主要是R132H突變，與患者預后相關［2，3，12］。在星形細胞瘤、少突膠質瘤和繼發(fā)膠質母細胞瘤中，＞90%患者存在IDH1突變。與之相反，在原發(fā)膠質母細胞瘤中，較少發(fā)生IDH1突變，表明IDH1突變在膠質瘤的發(fā)生中發(fā)揮關鍵作用。突變的IDH1獲得新的催化能力，將α-酮戊二酸進一步轉化成2-羥基戊二酸（2-HG）。代謝物2-HG可以抑制α-酮戊二酸依賴的與表觀遺傳有關的酶類（如 TET2，DNMT1），導致基因組 DNA 高度甲基化［13］。還可以通過抑制JAK活化，抑制細胞凋亡，促進腫瘤發(fā)生

［14］。最近的一項研究應用Cre-loxP系統(tǒng)構建了條件性IDH1突變（IDH1R132H）敲入小鼠模型［15］。在小鼠IDH1基因的外顯子3上引入R132H突變，并在外顯子2與3間的內含子中插入包括loxP位點的IDH1小基因（mini-gene，包括野生型外顯子3～9序列，3'非翻譯區(qū)和polyA信號）。條件性突變敲入小鼠與Nes-CreERT2小鼠（Nestin基因啟動子驅動Cre重組酶在神經(jīng)干/前體細胞特異表達，CreERT2為Cre的修飾形式，在他莫昔芬作用下發(fā)揮重組酶活性）雜交產生的后代成年后用他莫昔芬誘導可以在神經(jīng)干/前體細胞中表達突變的IDH1。分析發(fā)現(xiàn)該小鼠發(fā)生與膠質瘤早期相似的病變［15］。表現(xiàn)為小鼠SVZ神經(jīng)干/前體細胞數(shù)目增加，SVZ細胞侵襲并發(fā)生異位增殖形成膠質瘤前體灶。尤為重要的是，Wnt信號、端粒酶信號、細胞周期等活性增強及基因組DNA甲基化水平上升，且基因表達譜也與人膠質瘤相近。IDH1突變敲入小鼠模型有力支持了IDH1突變在膠質瘤發(fā)生早期的關鍵作用。IDH1突變敲入小鼠的表型為神經(jīng)干細胞的不可控增殖，與臨床上膠質瘤還是存在一定的差異，因此該小鼠模型適合于研究膠質瘤的發(fā)生與細胞起源，而不適合于膠質瘤的治療藥物篩選。人膠質瘤中，IDH1突變與P53突變共同發(fā)生，因此該小鼠組合p53基因敲除能否發(fā)生與人膠質瘤病理更加接近的小鼠膠質瘤值得進一步研究。

3.2 p53/Nf1條件性雙敲除小鼠模型 p53是一個抑癌基因，在多數(shù)的腫瘤包括膠質瘤中存在p53基因突變。Nf1（Neurofibromatosis type 1）也是一個抑癌基因，負向調控Ras信號，因此Nf1缺失導致Ras信號活化［16］。在小鼠中，僅敲除p53基因不能夠產生膠質瘤［17］。GFAP-Cre（Glial fibrillary acidic protein，在星形膠質細胞特異表達Cre，）介導的p53/Nf1雙基因條件性敲除小鼠發(fā)生典型的膠質瘤，存在偽柵欄樣（pseudopalisading）腫瘤細胞、壞死、小血管增生等典型特征［17］。該小鼠模型表明雙抑癌基因缺失足夠誘導小鼠產生膠質瘤，并存在低級別膠質瘤向高級別膠質瘤惡性進展現(xiàn)象。與此類似的，GFAP-Cre介導的p53與另一抑癌基因PTEN組合缺失小鼠也發(fā)生膠質母細胞瘤［18］。抑癌基因雙缺失小鼠膠質瘤模型是研究膠質瘤發(fā)生中腫瘤細胞起源問題的工具［19-20］，同時也可以用于膠質瘤靶向藥物的研發(fā)。雖然p53與Nf1雙突變能夠誘導小鼠產生類似人膠質瘤病變，但在Nf1突變在人膠質瘤中不常見，PDGFR或EGFR拷貝數(shù)增加引起Ras信號異?；罨?。

3.3 PDGF限制性過表達小鼠模型 PDGF/PDGFR信號屬于RTK信號，通過活化下游的PI3K/AKT和Ras/MAPK促進腫瘤細胞增殖和抗凋亡能力。PDGF阻止膠質前體細胞的分化，促進其自我更新。高級別膠質母細胞瘤中存在PDGFR基因拷貝數(shù)增加的現(xiàn)象，表明PDGF/PDGFR信號在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。在GFAP或Nestin陽性的神經(jīng)干細胞中通過病毒介導過表達PDGF可以誘導小鼠產生膠質瘤，大部分為低級別少突膠質瘤。這一小鼠模型表明小鼠膠質細胞或神經(jīng)干細胞中自分泌過量PDGF足以誘導小鼠神經(jīng)前體細胞產生腫瘤［21］。PDGF過表達加上抑癌基因INK4a-ARF敲除能夠誘導小鼠產生高級別膠質瘤。INK4a-ARF基因通過mRNA剪接編碼兩個功能不同蛋白，分別是細胞周期抑制分子p16INK4a和p19ARF［22］。INK4a-ARF基因敲除小鼠自發(fā)產生多種腫瘤［23］。INK4a-ARF基因敲除還可以與EGFR活化突變過表達組合產生膠質瘤樣病變［24］。INK4a-ARF基因敲除小鼠組合PDGF過表達膠質瘤小鼠模型用于篩選蛋白酪氨酸激酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)CSF-1R阻斷增加膠質瘤對RTK抑制劑的敏感性［25］。

PDGFB過表達是通過RCAS/tv-a系統(tǒng)實現(xiàn)的。RCAS病毒載體是鳥逆轉錄病毒（avian sarcoma-leukosis virus-A，ASLV-A）RCAS/tv-a系統(tǒng)衍生載體，限制性感染帶有tv-a受體的鳥類細胞［26］。哺乳動物細胞轉染表達tv-a受體，或通過轉基因方法在小鼠特異細胞或組織中表達tv-a受體，能夠實現(xiàn)RCAS載體攜帶的基因在特異細胞或組織中過表達。如在小鼠中，通過GFAP或Nestin基因的啟動子在膠質細胞或者神經(jīng)干細胞中特異表達tv-a受體的轉基因小鼠Gtv-a或Ntv-a，感染帶有EGFR或PDGFB的RCAS載體能夠在膠質細胞或神經(jīng)干細胞中特異過表達EGFR或PDGFB。同樣，通過RCAS載體表達干擾RNA，也能夠實現(xiàn)在小鼠特定表達t-va受體的細胞中敲降目的基因的表達。該系統(tǒng)在其它腫瘤的研究中也有應用［27-28］。

3.4 其它小鼠 GFAP基因啟動子驅動的癌基因在小鼠膠質細胞中高表達也可以誘導小鼠產生膠質瘤，比如GFAP-vsrc轉基因小鼠中，GFAP啟動子驅動Rous肉瘤病毒v-Src在小鼠膠質細胞特異表達，可以使小部分小鼠產生膠質瘤［29］。同樣GFAP基因啟動子驅動的V-Ha-RAS轉基因小鼠可以產生星形細胞瘤［30］。Src和Ras活化雖然能夠誘導小鼠產生膠質瘤樣病變，但臨床上，Src和Ras基因突變并不常見，因此這兩種膠質瘤小鼠模型目前已經(jīng)較少使用。

除RCAS/tv-a系統(tǒng)改變小鼠神經(jīng)細胞基因的方法外，最近也有研究把最新的基因編輯技術CRISPR/Cas9引入小鼠膠質瘤中［31-32］，簡單快速的在小鼠神經(jīng)細胞中敲除一個或多個抑癌基因。CRISPR/Cas9也可以應用于轉基因小鼠的制備，取代之前廣泛使用的胚胎干細胞中基因重組的方法。

4 展望

隨著新技術在臨床研究中的應用，目前對膠質瘤的分子病理已經(jīng)有較系統(tǒng)的認識，世界衛(wèi)生組織也建議在分子基礎上對膠質瘤進行分型管理和治療。動物水平的研究可以較好的驗證這些基因變異在腫瘤發(fā)生與惡性進展中的確切作用，補充了臨床研究。目前膠質瘤基礎研究多集中在成人膠質瘤方向，而兒童膠質瘤是兒童的主要腫瘤，與成人膠質瘤有不同的基因突變和組化特征。兒童膠質瘤的理解與治療的改善需要與之對應的動物模型的發(fā)展。

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浙江省科技廳公益基金項目（2015C37114）

31007 杭州市中醫(yī)院（張祖勇）

31005浙江大學醫(yī)學院病理與病理生理學系（程洪強）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院（董曉巧 王昊 張仕蓉）