黃科華 顏建英 林順和 余愛麗

子宮平滑肌中縫隙連接變化及CX43表達(dá)與子宮收縮乏力性產(chǎn)后出血關(guān)系的研究

黃科華 顏建英 林順和 余愛麗

目的 研究子宮平滑肌組織中縫隙連接（Gap junctions，GJs）數(shù)量變化及連接蛋白（Connexin，CX）43表達(dá)與子宮收縮乏力性產(chǎn)后出血的關(guān)系。方法 采用1∶1病例對(duì)照研究方法，選擇在我院行擇期剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦60例（宮縮乏力性產(chǎn)后出血者及同期無(wú)產(chǎn)后出血者各30例）。采用透射電鏡定量檢測(cè)產(chǎn)婦子宮下段平滑肌組織中GJs數(shù)量變化。分別采用RT-PCR技術(shù)及蛋白免疫印跡（Western blotting）技術(shù)檢測(cè)子宮下段平滑肌組織中CX43mRNA及其蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 子宮收縮乏力性產(chǎn)后出血組產(chǎn)婦子宮下段平滑肌組織中GJs數(shù)量及CX43mRNA及其蛋白表達(dá)水平均小于無(wú)產(chǎn)后出血組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)論 子宮下段平滑肌組織中GJs數(shù)量減少、CX43表達(dá)降低與子宮收縮乏力性產(chǎn)后出血發(fā)病密切相關(guān)。

縫隙連接；連接蛋白43；產(chǎn)后出血

產(chǎn)后出血是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦死亡最主要的產(chǎn)科并發(fā)癥，子宮收縮乏力是產(chǎn)后出血最重要的病因。子宮收縮以電傳導(dǎo)為基礎(chǔ)，有研究者認(rèn)為子宮肌細(xì)胞間的動(dòng)作電位通過(guò)GJs，以局部電流的方式傳遞。細(xì)胞間的GJs是由CX組成，既往研究［1］發(fā)現(xiàn)有多種連接蛋白存在于子宮平滑肌組織中，其中CX43表達(dá)較豐富，并與分娩發(fā)動(dòng)及產(chǎn)程調(diào)節(jié)等密切相關(guān)。該研究通過(guò)檢測(cè)子宮收縮乏力性產(chǎn)后出血產(chǎn)婦子宮下段平滑肌組織中縫隙連接數(shù)量的變化、CX43的基因及蛋白表達(dá)水平，從而探討其與宮縮乏力性產(chǎn)后出血發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源與分組

選擇60例在我院行子宮下段剖宮產(chǎn)的產(chǎn)婦，剖宮產(chǎn)指征為胎位異常、臍帶因素、羊水過(guò)少、社會(huì)因素。其中30例子宮收縮乏力性產(chǎn)后出血產(chǎn)婦為病例組，另30例無(wú)產(chǎn)后出血宮縮正常產(chǎn)婦為對(duì)照組。兩組產(chǎn)婦的年齡、孕周、分娩次數(shù)、凝血功能指標(biāo)水平等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1、表2。由子宮收縮乏力所引起的產(chǎn)后出血診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第八版《婦產(chǎn)科學(xué)》［2］，采用稱重法測(cè)量產(chǎn)后出血量。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有標(biāo)本采集及研究均經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并征得患者知情同意。在剖宮產(chǎn)術(shù)中，胎兒娩出后切取少許子宮下段切口上緣平滑肌組織，其中切取1 mm3用于檢測(cè)GJs數(shù)量，另取1.0～2.0 g用于檢測(cè)CX43蛋白及mRNA水平。

1.2.2 采用透射電鏡檢測(cè)子宮平滑肌中GJs 將3%戊二醛固定后的子宮平滑肌組織塊，50%～100%酒精逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂812和815混合包埋劑包埋，萊卡UC6 超薄切片機(jī)切片，鈾鉛染色后，用Tecnai G2 Spirit電子透射電鏡5 800倍下進(jìn)行觀察。

1.2.3 采用RT-PCR方法測(cè)定子宮平滑肌組織中CX43mRNA表達(dá)水平 CX43基因引物和探針均委托大連寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)和合成。由TaKaRa公司提供試劑，采用 2-△△CT方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.4 采用Western blot法測(cè)定子宮平滑肌組織中CX43蛋白表達(dá)水平 結(jié)果計(jì)算：蛋白表達(dá)的相對(duì)量=目的蛋白IOD值/內(nèi)參的IOD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示計(jì)量資料，采用成組t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮平滑肌組織中GJs數(shù)量的比較

病例組子宮平滑肌組織中縫隙連接數(shù)量為（3.35±2.57）個(gè)，對(duì)照組為（6.12±3.98）個(gè)，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 子 宮平滑肌組織中CX43蛋白及CX43mRNA表達(dá)量的比較

表1 兩組產(chǎn)婦的一般情況比較

表1 兩組產(chǎn)婦的一般情況比較

注：與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）

27．92±3．80 25．61±3．01分組 年齡（歲） 孕周（周） 分娩次數(shù) BMI（kg/m2）病例組對(duì)照組28．73±2．95 27．77±3．29 39．30±1．48 39．72±0．96 0．80±0．55 0．68±0．61

表2 兩組產(chǎn)婦出凝血相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果比較

表2 兩組產(chǎn)婦出凝血相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果比較

注：與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）

4．15±0．84 4．37±0．41分組 PLT（×109/L） PT（s） INR APTT（s） TT（s） Fib（g/L）病例組對(duì)照組213．50±49．15 226．22±53．31 12．26±0．64 11．99±0．72 0．92±0．05 0．89±0．06 33．67±2．87 32．69±2．46 16．29±0．83 16．34±0．73

圖1 病例組及對(duì)照組子宮平滑肌中GJs定量情況

圖2 子宮平滑肌組織中β-actin及CX43蛋白Western blotting測(cè)定結(jié)果

CX43蛋白及CX43mRNA在兩組子宮平滑肌組織中的表達(dá)水平見表3、圖2，病例組CX43蛋白及CX43mRNA定量均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

3.1 GJs在子宮平滑肌收縮中的作用

GJs［3］是相鄰的細(xì)胞之間形成的親水性管道，由連接蛋白（CX）組成的相鄰兩個(gè)連接子對(duì)合而成，不僅起著機(jī)械連接作用，更重要的是允許小分子物質(zhì)、第二信使及離子在相鄰細(xì)胞間自由交換，還通過(guò)電偶聯(lián)和化學(xué)偶聯(lián)的方式介導(dǎo)細(xì)胞間電和化學(xué)信號(hào)傳遞。本研究顯示子宮收縮乏力組子宮肌層中GJs數(shù)量少于子宮收縮正常組。這與國(guó)外相關(guān)研究結(jié)果類似，如：既往研究［4］通過(guò)定量檢測(cè)鼠子宮平滑肌組織中的GJs，發(fā)現(xiàn)分娩前非收縮子宮肌節(jié)中比分娩后收縮子宮肌節(jié)含有更多的GJs。妊娠終末期及分娩期子宮肌層中GJs較妊娠早期數(shù)量增加，體積增大，可使相鄰的子宮平滑肌細(xì)胞胞漿互通，細(xì)胞間偶聯(lián)加強(qiáng)，提供低電阻通路，從而使子宮肌層收縮增強(qiáng)。

有多種因素可通過(guò)影響連接子開放狀態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)GJs的功能，如：細(xì)胞內(nèi)的pH降低同時(shí)伴隨著GJs減少，若子宮肌處于缺氧狀態(tài)，子宮肌細(xì)胞內(nèi)酸性物質(zhì)增多，可發(fā)生酸中毒致連接子閉合，GJs減少，從而導(dǎo)致子宮收縮乏力。子宮肌細(xì)胞內(nèi)外的Ca2+等也可影響連接子的開放調(diào)節(jié)GJs通道的功能［5］，因此臨床上發(fā)生子宮收縮乏力時(shí)可通過(guò)增加血清鈣濃度來(lái)促進(jìn)子宮收縮。此外，研究還發(fā)現(xiàn)對(duì)子宮的機(jī)械性牽張刺激亦能使子宮肌細(xì)胞膜上的GJs數(shù)量增加。但GJs的功能受CX的數(shù)量及活性直接影響［6］，且CX的磷酸化和去磷酸化可決定GJs通道的通暢性。

3.2 子宮平滑肌中CX43mRNA及蛋白表達(dá)與宮縮乏力性產(chǎn)后出血的關(guān)系

由于CX43mRNA及蛋白在子宮下段的表達(dá)量大于子宮體部，該研究收集子宮下段剖宮產(chǎn)切口上緣的平滑肌組織進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮縮乏力組子宮下段平滑肌組織中CX43mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于宮縮正常組。提示CX43的表達(dá)水平可能與宮縮乏力性產(chǎn)后出血相關(guān)。CX43對(duì)子宮收縮性的調(diào)節(jié)可能主要與GJs的數(shù)量和功能狀態(tài)相關(guān)。但研究［7］還發(fā)現(xiàn)CX43能影響游離型谷氨酸受體、水通道蛋白、囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子等，并與之相互作用發(fā)揮功能。

CX43在未妊娠婦女子宮平滑肌組織中無(wú)明顯表達(dá)，在妊娠早期子宮肌中低表達(dá)，在臨近足月時(shí)逐漸增加，臨產(chǎn)時(shí)開始大量合成，分娩發(fā)動(dòng)時(shí)迅速裝配成GJs。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究人類和鼠的子宮平滑肌，發(fā)現(xiàn)CX43在早產(chǎn)和足月產(chǎn)時(shí)表達(dá)都顯著增加，但其表達(dá)量相比較無(wú)明顯差異。Tong等研究［8］發(fā)現(xiàn)鼠子宮平滑肌中的CX43基因功能喪失可使平滑肌細(xì)胞間偶聯(lián)受損，導(dǎo)致產(chǎn)程延長(zhǎng)。以上研究均表明CX43在與子宮平滑肌收縮相關(guān)的一系列過(guò)程中起重要作用， 而GJs是CX43發(fā)揮功能的主要結(jié)構(gòu)載體，改變子宮平滑肌中GJs的數(shù)量及功能狀態(tài)直接影響肌細(xì)胞之間動(dòng)作電位的傳遞速度，密切調(diào)節(jié)子宮平滑肌的收縮功能。

子宮平滑肌組織中CX43的表達(dá)受所中因素調(diào)節(jié)。國(guó)內(nèi)外有研究［9］發(fā)現(xiàn)CRH、雌孕激素、PKC活化因子等都可通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Jun和Fos的調(diào)控而調(diào)節(jié)CX43mRNA和蛋白的表達(dá)。此外，前列環(huán)素能通過(guò)cAMP/PKA信號(hào)途徑促進(jìn)CX43蛋白的表達(dá)，內(nèi)源性一氧化氮（NO）抑制CX43的表達(dá)。Mendelson［10］等認(rèn)為，活化的核轉(zhuǎn)錄因子κB以及炎癥反應(yīng)均可促進(jìn)CX43的表達(dá)。由此推測(cè)，上述激素或因子在子宮收縮乏力性產(chǎn)后出血產(chǎn)婦體內(nèi)可能存在異常，可能通過(guò)調(diào)節(jié)CX43表達(dá)來(lái)影響子宮平滑肌收縮，對(duì)以上因子的研究將可能為宮縮乏力性產(chǎn)后出血的防治提供新的思路。

總之，CX43在子宮收縮乏力性產(chǎn)后出血的發(fā)生發(fā)展中起著不可或缺的作用，該機(jī)制可能為CX43表達(dá)降低使GJs形成減少以及功能受損，或通過(guò)調(diào)控其他跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)因子及通道蛋白等途徑調(diào)節(jié)子宮平滑肌的收縮。了解GJs及CX43在宮縮乏力性產(chǎn)后出血中的作用及機(jī)制對(duì)產(chǎn)后出血的防治有重要理論指導(dǎo)意義。

表3 子宮平滑肌組織中CX43、CX43mRNA表達(dá)水平

表3 子宮平滑肌組織中CX43、CX43mRNA表達(dá)水平

注：與同期對(duì)照組比較，*P＜0．05

0．72±0．33*1．09±0．69分組 例數(shù) CX43 CX43mRNA病例組對(duì)照組30 30 0．08±0．02*0．12±0．05

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Significance of Gap Junctions Quantity and Connexin43 Expression in Myometrium of Parturient Women in Postpartum Hemorrhage

HUANG Kehua YAN Jianying LIN Shunhe YU Aili
Department of Obstetrics and Gynecology，F(xiàn)ujian Provincial Maternity and Children’s Hospital of Fujian Mediclal University，F(xiàn)uzhou Fujian 350001，China

Objective To discuss the significance of gap junctions and connexin 43 in the pathogenesis of postpartum hemorrhage（PPH）caused by uterine atony． Methods A case-control 1:1 observational study was conducted． 60 cases of elective cesarean section were selected in our hospital（the same period of uterine atony postpartum hemorrhage without postpartum hemorrhage in 30 cases）． Transmission electron microscopic was used to detect the quantity of gap junctions． RT-PCR was used to detecte the level of CX43 mRNA in myometrium，western blotting was used determined the CX43 protein level． Results The number of GJs and the expression of CX43mRNA and protein in the smooth muscle of lower uterine segment of postpartum hemorrhage group were lower than those without postpartum hemorrhage, the difference was statistically significant（P＜ 0．05）． Conclusion The expression of CX43 and quantity of gap junctions in myometrium are lower than that of their controls，and there is close correlation between expression and contractile function． Decreases of gap junctions and lower exprssion of CX43 in myometrium may be closely related to atony PPH．

Gap junctions，Connexin43，Postpartum hemorrhage

R714．7

A

1674-9316（2016）23-0040-04

10．3969/j．issn．1674-9316．2016．23．020

福建省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2009Y0008） 基金項(xiàng)目：福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題（2009-CXB-32）

福建醫(yī)科大學(xué)附屬福建省婦幼保健院婦產(chǎn)科，福建 福州 350001 通訊作者：顏建英，E-mail：86031755@qq．com