武嘉庚

（青海省藥品檢驗檢測院藏藥室，青海西寧810000）

姜黃素通過下調(diào)m icroRNA-211表達促進結(jié)腸癌細胞的凋亡及其機制

武嘉庚

（青海省藥品檢驗檢測院藏藥室，青海西寧810000）

目的檢測姜黃素對結(jié)腸癌細胞中微小RNA 211（m icroRNA 211，m iR-211）表達的影響并探討miR-211調(diào)控結(jié)腸癌細胞增殖和凋亡的可能機制。方法使用MTT法和流式細胞術(shù)檢測不同濃度姜黃素在不同時間點對結(jié)腸癌細胞增殖和凋亡的影響；使用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測不同濃度姜黃素對結(jié)腸癌細胞中m iR-211表達的影響；使用生物信息學預測m iR-211下游靶基因TP53INP1并使用熒光素酶報告基因法驗證其結(jié)合；用m iR-211模擬物（m iR-211 m im ics）檢測其對姜黃素處理的結(jié)腸癌細胞增殖的影響，同時使用W estern blot法檢測其對TP53INP1蛋白表達的影響；用TP53INP1小干擾RNA檢測其對姜黃素處理的結(jié)腸癌細胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果相較于未處理組，姜黃素在10～50μmol/L濃度可抑制腫瘤細胞增殖并促進其凋亡（P<0.05）。姜黃素可抑制腫瘤細胞中miR-211的表達，并具有時間和劑量依賴性（P<0.05）；此外，miR-211下游靶基因TP53INP1蛋白表達量上調(diào)（P<0.05）。用miR-211轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細胞可逆轉(zhuǎn)姜黃素對其增殖的抑制作用，并且TP53INP1表達下調(diào)（P<0.05）；用TP53INP1小干擾RNA可逆轉(zhuǎn)姜黃素對結(jié)腸癌細胞增殖和凋亡的影響（P<0.05）。結(jié)論姜黃素可通過下調(diào)m iR-211抑制結(jié)腸癌細胞增殖并促進其凋亡，并且TP53INP1是m iR-211下游調(diào)控蛋白之一。

結(jié)腸癌；m iR-211；姜黃素；TP53INP1；凋亡

結(jié)腸癌在全球范圍內(nèi)是腫瘤引起死亡的重要原因之一[1]，并且其發(fā)生率逐年升高。由于早期篩查經(jīng)濟成本受限，大部分明確診斷的結(jié)腸癌均處于晚期階段。雖然目前治療手段不斷改善，但結(jié)腸癌的預后仍舊不佳。因此，新的治療方式仍需不斷開發(fā)。

植物提取的化學物質(zhì)由于其抗腫瘤特點受到廣泛關(guān)注。姜黃素作為一種提純的中藥單體，研究發(fā)現(xiàn)具有多種藥理作用，包括抗炎、抗氧化、抗腫瘤等。在多種腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素可明顯抑制腫瘤細胞增殖并促進其凋亡，但具體分子機制研究不清[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是體內(nèi)一種非編碼RNA，在細胞增殖、凋亡、分化等過程中發(fā)揮重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA異常表達跟腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]；并且姜黃素可調(diào)控miRNA表達影響腫瘤的進展。MicroRNA 211（miR-211）在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，但姜黃素能否通過調(diào)控miR-211表達影響腫瘤進展尚不明確。本研究旨在探討miR-211在姜黃素抑制結(jié)腸癌細胞HCT116增殖和凋亡中的作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌細胞系HCT116（凱基公司，中國），DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司，美國），血清（Hyclone公司，美國），姜黃素（Sigma公司，美國），MTT粉（Sigma公司，美國），Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（上海生物工程有限公司，中國），雙熒光素酶報告基因表達質(zhì)粒和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega公司，美國），Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及實時熒光定量PCR試劑盒（寶生物工程公司，中國）。miR-211正向引物5'-CTGCTTGGACCTGTGA CCTGT-3'，反向引物5'-TCTGCAGTAGAGGTGACCA-3'；U6正向引物5'-GCTTCGGCAGCACATATAC TAAAAT-3'，反向引物5'-CGCTTCACGAATTTGCGT GTCAT-3'，均由寶生物工程合成。miR-211模擬物（miR-211 mimics）、miR-211下游靶基因TP53INP1（tumor protein P53-inducible nucle ar protein 1，TP53INP1）siRNA構(gòu)建以及轉(zhuǎn)染試劑盒（銳博公司，中國），TP53INP1兔抗人單克隆抗體（Abcam公司，英國），抗β-actin多克隆抗體、二抗（凱基公司，中國），PVDF膜（Millipore公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及藥物處理使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HCT116細胞，培養(yǎng)基含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素；培養(yǎng)條件：37℃，5%二氧化碳CO2。當細胞生長至70%～80%融合時，細胞給予不同濃度姜黃素（10、20、30、40和50μmol/L）處理不同時間（6、12、24和48 h），檢測其增殖和凋亡情況。

1.2.2 MTT檢測細胞增殖HCT116細胞（5 000個/孔）種植于96孔板中，培養(yǎng)過夜便于貼附；加入不同濃度姜黃素，分別于不同時間點用MTT法檢測細胞活力。未處理組細胞作為陰性對照。每孔加入5mg/m l MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去培養(yǎng)液終止反應，每孔加入150μl DMSO溶解藍紫色沉淀，低速震蕩10min；在波長490 nm處檢測吸光度值。結(jié)果分析以未處理組為100%，計算抑制率。每組試驗重復3次。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI染色和流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡HCT166細胞以10 000個細胞/孔種植于96孔板中，培養(yǎng)過夜便于貼附；加入不同濃度姜黃素培養(yǎng)12 h或者加入30μmol/L姜黃素培養(yǎng)不同時間。未處理組細胞作為陰性對照。胰酶消化細胞，PBS洗滌，加入300μl結(jié)合液重懸，加入10μl Annexin V-FITC室溫避光孵育15min，上機前加入5μl PI，并補充200μl結(jié)合液，流式細胞儀上機檢測。Annexin V陽性細胞為凋亡細胞。所有試驗重復3次。

1.2.4 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測細胞中m iR-211表達實驗分為3部分：總RNA的提取、RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA、實時熒光定量PCR。總RNA提取使用Trizol法：當細胞生長至培養(yǎng)瓶80%～90%時，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌，加入1m l Trizol裂解細胞，轉(zhuǎn)移至EP管，靜置5min；加入氯仿200μl，震蕩15 s，室溫靜置5min，離心取上清；加入等體積異丙醇，混勻后室溫靜置10min，離心；棄上清液，加入預冷75%乙醇1ml洗滌，棄上清；加入DEPC水溶解沉淀；紫外分光光度計檢測吸光度，計算RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄按照試劑盒說明書要求進行操作：反應體系20μl，其中5×Prime Script Buffer 4μl，逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，預混引物1μl，RNA 1μg；反應條件42℃30min，85℃5 s；cDNA冷凍保存。qRT-PCR在ABI7500 Fast上進行，反應體系按照說明書操作；兩步法擴增，預變性階段95℃30 s1個循環(huán)；PCR反應階段：95℃3 s，60℃30 s，40個循環(huán)。結(jié)果分析根據(jù)miR-211和U6測出的CT值差異，采用ΔΔCT法計算miR-211相對表達量。所有試驗重復3次。

1.2.5 細胞轉(zhuǎn)染對于TP53INP1敲除實驗，HCT116細胞按105個/孔種植于6孔板中，DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，無血清培養(yǎng)基沖洗；根據(jù)轉(zhuǎn)染操作說明瞬時轉(zhuǎn)染TP53INP1 siRNA和對照siRNA。對于miR-211過表達實驗，人miR-211mimics，分別轉(zhuǎn)染進入HCT116細胞。轉(zhuǎn)染24 h后加入40μmol/L姜黃素處理24 h，收集細胞進一步分析。

1.2.6 W estern blot檢測TP53INP1蛋白表達HCT116細胞處理后加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解細胞，冰上作用40min，10 000 r/min 15min，獲得上清液；根據(jù)BCA法測定蛋白濃度；蛋白樣本處理：加入1/5體積5×SDS-PAGE上樣緩沖液，充分混勻，100℃煮沸5min；電泳：制備SDS-PAGE凝膠，根據(jù)蛋白濃度每孔加入一定量蛋白樣本，電泳；轉(zhuǎn)膜：切膠并剪下相應大小PVDF膜，在轉(zhuǎn)膜液用一定電流將蛋白轉(zhuǎn)入PVDF膜上；脫脂奶粉封閉非特異性位點；一抗anti-TP53INP1（1∶1 000），anti-β-actin（1∶2 000）4℃孵育過夜；二抗孵育；顯色反應。結(jié)果采用Image J軟件計算灰度值進行數(shù)據(jù)分析。所有試驗重復3次。

1.2.7 熒光素酶報告基因法檢測m iR-211與靶基因TP53INP1的結(jié)合pGL3-TP53INP1-3’UTR和pGL3-TP53INP1-3’UTR mutant質(zhì)粒購自Promega公司。在轉(zhuǎn)染前，HCT116細胞按105個/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h。根據(jù)檢測試劑盒說明書操作，熒光素酶報告基因表達質(zhì)粒和pRL-TK共同轉(zhuǎn)染細胞，同時給予miR-211 mimics和對照組。24h后檢測熒光素酶活性。螢火蟲熒光素酶活性根據(jù)相應海腎熒光素酶活性進行標化。所有試驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間均數(shù)的比較用單因素方差分析，在方差分析有統(tǒng)計學意義的基礎上，再行LSD-t檢驗（兩濃度組間）或配對t檢驗（兩時間點間）進行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對結(jié)腸癌細胞HCT116增殖和凋亡的影響

HCT116結(jié)腸癌細胞用不同濃度姜黃素（10、20、30、40和50μmol/L）處理，不同時間（6、12、24和48h）細胞活性用MTT法檢測。結(jié)果顯示（見圖1A），相較于未處理組，10～50μmol/L濃度姜黃素對HCT116均有不同程度抑制，隨著劑量的增加抑制率上升，隨著處理時間的延長抑制率同樣逐漸增加；其中24和48 h抑制效應顯著增加，分別是17%～55%和20%～76%（P<0.05）。

用流式細胞術(shù)檢測姜黃素對HCT116細胞凋亡的影響。不同濃度姜黃素處理24 h后，結(jié)果顯示（見圖1B），10～50μmol/L姜黃素對HCT116凋亡均有不同程度促進（9.25%～42.34%，P<0.05）。30μmol/L姜黃素處理不同時間結(jié)果顯示（見圖1C），隨著時間延長，姜黃素促進凋亡效應逐漸增加（6.34%～32.23%，P<0.05）。

2.2 姜黃素對HCT116細胞m iR-211表達的影響

HCT116細胞用不同濃度姜黃素處理24h后，收集細胞，用qRT-PCR法檢測HCT116細胞中miR-211的表達。結(jié)果顯示（見圖2），相較于未處理組，10～50μmol/L姜黃素均可抑制miR-211的表達，且具有劑量依賴性（14%～62%，P<0.05）。

2.3 MiR-211下游靶基因的預測及驗證

為了進一步研究miR-211對HCT116細胞增殖和凋亡的影響，采用生物信息學方法，用Target Scan數(shù)據(jù)庫篩選miR-211跟增殖和凋亡相關(guān)的下游靶基因。結(jié)合文獻分析，本研究選擇TP53INP1作為miR-211潛在下游靶基因。為了驗證預測的TP53INP1是否為miR-211靶基因，能否和TP53INP1的3’UTR結(jié)合，將miR-211mimics與構(gòu)建的TP53INP1-wt、TP53INP1-mut質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT116細胞，24 h后檢測熒光素酶活性。結(jié)果顯示（見圖3），相較于對照組，miR-211mimics可抑制TP53INP1-wt載體熒光素酶活性（抑制率為41%，P<0.05），而對TP53INP1-mut熒光素酶活性無明顯影響。實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)庫預測結(jié)果一致，說明miR-211可以和TP53INP1 3’UTR結(jié)合。

圖1 不同濃度姜黃素處理HCT116不同時間對其增殖和凋亡的影響

2.4 過表達m iR-211對HCT116細胞TP53INP1蛋白表達和增殖的影響

檢測高表達miR-211對姜黃素處理的HCT116細胞生物學活性的影響。Western blot結(jié)果顯示（見圖4A），相較于對照組，高表達miR-211可抑制姜黃素處理組HCT116細胞TP53INP1蛋白水平的表達（P<0.05）。MTT結(jié)果顯示（見圖4B），相較于姜黃素處理組，高表達miR-211可緩解姜黃素對HCT116細胞增殖的抑制作用（P<0.05）。

圖2 不同濃度姜黃素對HCT116細胞中m iR-211表達的影響

圖3 m iR-211作用于TP53INP1 3’UTR抑制熒光素酶活性

2.5 抑制TP53INP1基因表達對HCT116細胞增殖和凋亡的影響

用siRNA技術(shù)研究TP53INP1在姜黃素抗腫瘤效應中的作用。用TP53INP1 siRNA和對照siRNA分別轉(zhuǎn)染HCT116細胞，再給予40μmol/L姜黃素作用24 h，MTT結(jié)果顯示（見圖5A），相較于對照組，TP53INP1 siRNA組可逆轉(zhuǎn)姜黃素對HCT116的抑制效應（P<0.05）。凋亡實驗結(jié)果顯示（見圖5B），相較于對照組，TP53INP1 siRNA組可抑制姜黃素促進HCT116細胞凋亡作用（P<0.05）。

圖4 高表達m iR-211對HCT116細胞TP53INP1蛋白表達和增殖的影響

圖5 TP53INP1 siRNA對HCT116細胞增殖和凋亡的影響

3 討論

姜黃素作為一種中藥提純的單體，具有明確的抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過作用NF-κB、Notch、P53、Caspase-3、細胞周期蛋白D1等途徑促進腫瘤細胞凋亡并抑制其增殖[4-5]，但具體分子機制尚不清楚。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素可促進結(jié)腸癌細胞HCT116的增殖并抑制其凋亡，效應具有時間和劑量依賴的特點。

miRNA是長度約22個核苷酸左右的單鏈非編碼RNA序列，主要通過結(jié)合目標mRNA 3’UTR非編碼區(qū)來抑制其功能，從而促進其降解或者抑制蛋白翻譯。在腫瘤學研究中，異常的miRNA表達跟腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。計算機模擬預測發(fā)現(xiàn)每個miRNA可調(diào)節(jié)多個靶基因，并且人類超過50%編碼基因都可受到miRNA調(diào)控。因此，不同腫瘤miRNA表達特征可作為潛在的早期診斷、治療以及預后判斷的重要指標。近期的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素的抗腫瘤效應和miRNA的表達密切相關(guān)。在胰腺癌的研究中，MA等[6]發(fā)現(xiàn)姜黃素可上調(diào)miR-7表達，從而下調(diào)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制腫瘤細胞生長和侵襲轉(zhuǎn)移。在非小細胞肺癌研究中，ZHANG等[7]發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過下調(diào)miR-186促進A549細胞凋亡。在膀胱癌研究中，SAINI等[8]發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過調(diào)節(jié)miR-203影響Src-Akt軸抑制腫瘤。該研究顯示，姜黃素通過調(diào)節(jié)miRNA表達是其抗腫瘤的重要機制之一。因此，篩選出姜黃素在不同腫瘤中特異性調(diào)節(jié)的miRNA分子是腫瘤靶向治療重要方向。

結(jié)腸癌在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)生率和死亡率。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA和結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。ASANGANI等[9]首次發(fā)現(xiàn)miR-21可促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，并且結(jié)腸癌中高表達的miR-21可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的方式抑制抑癌基因程序性細胞凋亡因子4表達。ZHANG等[10]通過高通量測序分析結(jié)腸癌患者miRNA表達譜差異，篩選出得特異性miRNA可預測術(shù)后化療效果并可判斷復發(fā)情況。姜黃素調(diào)控結(jié)腸癌miRNA表達主要研究的是miR-21，對其他miRNA研究不多，本研究主要就miR-211進行研究。

miR-211在不同腫瘤中具有不同作用特點。CHANG等[11]發(fā)現(xiàn)在口腔腫瘤中miR-211高表達，并且其與腫瘤預后不佳相關(guān)。在胰腺癌研究中發(fā)現(xiàn)[12]，低表達miR-211的患者具有更短的中位生存時間，但具體機制不清。CAI等[13]在結(jié)直腸癌研究中發(fā)現(xiàn)，miR-211可通過下調(diào)抑癌基因染色質(zhì)域解旋酶DNA結(jié)合蛋白5促進腫瘤生長。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細胞HCT116高表達miR-211，并且姜黃素可抑制miR-211表達，效應具有劑量依賴性。

研究已報道多個miR-211下游靶基因，如Brn2（brain 2）[14]、NUAK1（NUAK family SNF1-like kinase 1）[15]、TGFβRⅡ（transforming growth factorβreceptorⅡ）等[16]，這些靶基因具有不同生物學功能。本研究采用Target Scan數(shù)據(jù)庫篩選miR-211下游靶基因，發(fā)現(xiàn)TP53INP1（Tumor protein P53-inducible nuclear protein 1）可作為候選靶基因。TP53INP1是一種抑癌基因，在多種腫瘤組織中表達下調(diào)，可調(diào)控P53活化狀態(tài)，跟細胞死亡、細胞周期停滯以及細胞遷移密切相關(guān)[17]。SEUX等[18]研究發(fā)現(xiàn)，TP53INP1可調(diào)控分泌型富含半胱氨酸酸性蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC）的表達抑制胰腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。在肝癌中研究發(fā)現(xiàn)[19]，上調(diào)的miR-182可通過下調(diào)TP53INP1，從而增加腫瘤耐藥。因此，筆者推測TP53INP1的表達增高跟姜黃素誘導的HCT116凋亡有關(guān)。實驗結(jié)果表明，姜黃素處理后TP53INP1蛋白表達增高，并且干擾TP53INP1表達能促進HCT116細胞增殖、抑制其凋亡。

綜上所述，miR-211在調(diào)控姜黃素的抗腫瘤效應方面具有重要作用，其機制可能是通過下調(diào)TP53INP1蛋白表達，從而促進腫瘤細胞增殖、抑制其凋亡。

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（張蕾編輯）

Curcum in promotes apoptosis in colon cancer by downregulating m iR-211 expression

Jia-gengWu
(Tibetan Medicine Room,Qinghai Provincial Drug Inspection and Testing Institute, Xining,Qinghai810000,China)

ObjectiveTo study the effect of curcumin on miR-211 in colon cancer cells and clarify amiR-211-mediated mechanism which plays a role in the anti-tumor effects of curcumin.MethodsThe dose-effect and timeeffect relationship of curcumin on HCT116 was tested by MTT assay and flow cytometry.Expression level ofmiR-211 in curcumin-treated HCT116 was detected by qRT-PCR.TP53INP1 was predicted as a target ofmiR-211 using GeneTarget database and confirmed by dual luciferase reporter assays.Additionally,the effect of upregulatingmiR-211 bymiR-211 mimics or silencing TP53INP1 by siRNA on curcumin-treated HCT116 was examed by MTT and flow cytometry.ResultsCompared with untreated HCT116 cells,curcumin at 10-50μmol/L inhibited cell proliferation and induced apoptosis in a dose-dependent and time-dependentmanner.Curcumin also produced a dose and time dependent suppression of miR-211(P＜0.05).Moreover,the protein level of TP53INP1 was significantly elevated in crucumin-treated HCT116 cells(P＜0.05).Transfection of HCT116 withmiR-211mimicsor TP53INP1 small interfering RNA significantly reversed the effect of curcumin on HCT116,compared to corresponding controls(P＜0.05).ConclusionsOur data suggesta novelmolecularmechanism in which inhibition of miR-211 and upregulation of TP53INP1mediate the anticancer activities of curcumin in colon cancer cells.

colon cancer;miR-211;curcumin;TP53INP1;apoptosis

R 735.35

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.24.004

1005-8982（2016）24-0018-06

2016-07-06