劉月秋 劉 輝

（中國人民解放軍第210醫(yī)院，遼寧 大連 116021）

·實驗報告·

丹參酮ⅡA對大鼠腦缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制研究

劉月秋 劉 輝△

（中國人民解放軍第210醫(yī)院，遼寧 大連 116021）

目的探索丹參酮ⅡA對大鼠腦缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制。方法 30只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注損傷組和丹參酮ⅡA組，每組10只。采用線栓法構(gòu)建大鼠大及至中動脈局灶所血再灌注損傷模型。術(shù)后2 h拔除栓線，制備缺血2 h再灌注損傷模型。假手術(shù)組僅分離頸總動脈，不夾閉。丹參酮ⅡA組在術(shù)前15 min腹腔注射丹參酮ⅡA劑量（1 mL/kg），腦所血再灌注損傷組和假手術(shù)組術(shù)前15 min腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液，術(shù)后24 h斷頭處死動物，觀察大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)改變以及腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、Wnt、β-catenin、cyclin D1、survivin、p53、Bax和BCL-2的表達(dá)，評價丹參酮ⅡA對大鼠腦缺血再灌注損傷的作用。結(jié)果與假手術(shù)組相比較，腦缺血再灌注損傷組腦組織損傷評分明顯升高 （P＜0.05），Wnt、β-catenin、cyclin D1、survivin、p53以及Bax的mRNA和蛋白水平上升（P＜0.05），BCL-2的mRNA和蛋白水平下降 （P＜0.05），TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)和血清水平上升（P＜0.05）；與腦缺血再灌注損傷組相比較，丹參酮ⅡA組上述指標(biāo)均顯著改善（P＜0.05）。結(jié)論丹參酮ⅡA可減輕腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與其可抑制Wnt/β-catenin/p53信號途徑介導(dǎo)的炎癥和凋亡相關(guān)。

丹參酮ⅡA 大鼠 腦缺血再灌注損傷 炎癥 凋亡 Wnt/β-catenin/p53

腦缺血再灌注損傷是腦供血中斷后，重新恢復(fù)腦血供導(dǎo)致腦損傷反而加重的臨床危相，是導(dǎo)致人類致死和致殘的重要原因，僅次于心臟疾病和癌癥。因此減輕腦缺血再灌注損傷對臨床具有重要的現(xiàn)實意義［1-2］。丹參酮ⅡA是傳統(tǒng)中藥丹參的一種成分，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗凋亡，抗炎，抗腫瘤等生物學(xué)活性［3-4］，而凋亡和炎癥是導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷重要原因［5-6］。因此本實驗以大鼠為研究對象，探討丹參酮ⅡA對腦缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（220± 20）g，由武漢大學(xué)實驗動物中心提供（合格證號SCXK鄂2014-0007）。均提前2周購入，放置在SPF級動物飼養(yǎng)室內(nèi)喂養(yǎng)。丹參酮ⅡA磺酸鈉（上海第一生化藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20026249），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%；白介素-6（IL-6），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-8（IL-8）ELISA檢測盒 （Ebioscience，USA），β-actin（abgent，USA），BCL-2、Bax、Wnt、β-catenin、cyclin D1、survivin以及p53（CST，USA）。

1.2 分組與造模 30只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham），腦缺血再灌注損傷組（IRI）和丹參酮ⅡA組（TSN），每組10只。參照Liu GD等［7］方法，采用線栓法構(gòu)建大鼠大腦中動脈局灶缺血再灌注損傷模型，術(shù)后2 h拔除栓線，制備缺血2 h再灌注損傷模型。假手術(shù)組僅分離頸總動脈，不夾閉。丹參酮ⅡA組在術(shù)前15 min腹腔注射丹參酮ⅡA劑量（1 mL/kg），腦缺血再灌注損傷組和假手術(shù)組術(shù)前15 min腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液，術(shù)后24 h斷頭處死動物。

1.3 觀察項目 1）腦組織病理組織學(xué)檢查。腦組織置于4%多聚甲醛液4℃后固定1周。依次脫水、透明、浸蠟及包埋，行厚8 μm冠狀切片、常規(guī)HE染色、封片，光鏡下觀察，損傷評分參考文獻(xiàn)［6］。2）RT-PCR檢測。RT-PCR法檢測各組腦組織Wnt，β-catenin，cyclin D1，survivin，p53，Bax，BCL-2，IL-6，TNF-α和IL-8的表達(dá)水平，具體方法參考文獻(xiàn)［7］。3）ELISA檢測。按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測血清中IL-6，TNF-α和IL-8表達(dá)水平。4）Western blotting檢測腦組織Wnt，β-catenin，cyclin D1，survivin，p53，Bax 以 及BCL-2等蛋白水平的表達(dá)。取各組腦組織50 mg，采用westernbloting方法檢測腦組織Wnt，β-catenin，cyclin D1，survivin，p53，Bax以及BCL-2的表達(dá)，具體步驟參考文獻(xiàn)［7］。

表1 實時定量PCR檢測的引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（s）表示，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組腦組織病理改變的比較 見圖1，表2。與Sham組相比，IRI組神經(jīng)元細(xì)胞損傷，固縮核和神經(jīng)元染色明顯增加（P＜0.05），而TSN組神經(jīng)元細(xì)胞損傷，固縮核和神經(jīng)元染色明顯降低（P＜0.05），提示TSN預(yù)處理可明顯腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的腦損害。

圖1 各組腦組織病理學(xué)改變的比較（HE染色，200倍）

表2 各組腦組織損傷評分比較（分，s）

表2 各組腦組織損傷評分比較（分，s）

與Sham組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與TSN組比較，△P＜0.05。下同。

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2.2 各組腦組織Wnt/β-catenin/p53信號通路關(guān)鍵因子表達(dá)的比較 見圖2，表3~4。與Sham組相比，IRI組Wnt，β-catenin和p53 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平均明顯增加（P＜0.05），而TSN組與IRI組相比Wnt，β-catenin和p53 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平均明顯減少（P＜0.05）。

圖2 各組腦組織Wnt，β-catenin和p53蛋白表達(dá)水平比較

表3 各組腦組織促炎癥細(xì)胞因子Wnt，β-catenin和p53 mRNA表達(dá)水平比較（s）

表3 各組腦組織促炎癥細(xì)胞因子Wnt，β-catenin和p53 mRNA表達(dá)水平比較（s）

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表4 各組腦組織促炎癥細(xì)胞因子Wnt，β-catenin和p53蛋白表達(dá)水平比較（s）

表4 各組腦組織促炎癥細(xì)胞因子Wnt，β-catenin和p53蛋白表達(dá)水平比較（s）

2.3 各組腦組織cyclin D1和survivin的表達(dá)比較見圖3，表5~6。與Sham組相比，IRI組cyclin D1和survivin mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)明顯增加 （P＜0.05），而TSN組與IRI組相比cyclin D1和survivin mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均明顯減少（P＜0.05）。

圖3 各組腦組織cyclin D1和survivin蛋白表達(dá)的比較

表5 各組腦組織cyclin D1和survivin mRNA表達(dá)水平比較（s）

表5 各組腦組織cyclin D1和survivin mRNA表達(dá)水平比較（s）

表6 各組腦組織cyclin D1和survivin mRNA蛋白表達(dá)比較（s）

表6 各組腦組織cyclin D1和survivin mRNA蛋白表達(dá)比較（s）

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2.4 各組促炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-6和IL-8表達(dá)的比較 見表7、8。與Sham組相比，IRI組TNF-α，IL-6和IL-1β腦組織mRNA的表達(dá)和血清水平均明顯增加（P＜0.05）。而TSN組與IRI組相比，促炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-6和IL-1β表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。

表7 各組腦組織促炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-6和IL-1 mRNA表達(dá)水平比較（s）

表7 各組腦組織促炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-6和IL-1 mRNA表達(dá)水平比較（s）

組 別 n TNF-α（mRNA） IL-6（mRNA）IL-1（mRNA）Sham 10 IRI 10 1.00±0.01 1.00±0.02 0.98±0.09 12.13±1.20**5.33±0.24*7.52±0.75*TSN 105.20±0.31△1.52±0.25△2.52±0.42△

表8 各組血清促炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-6和IL-1分泌水平比較（s）

表8 各組血清促炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-6和IL-1分泌水平比較（s）

組別 n TNF-α IL-6 IL-1 Sham 10 IRI 10 98.67±10.23 110.62±21.02 100.89±23.35 1528.45±212.67**646.85±52.79*956.79±54.43*TSN 10452.33±143.91△221.46±32.54△455.15±42.40△

2.5 各組腦組織Bax和BCL-2的表達(dá)比較 見圖4，表9~表10。與Sham組相比，IRI組Bax mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.05），BCL-2 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均明顯減少（P＜0.05），而TSN組與IRI組相比，Bax mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均明顯減少（P＜0.05），而BCL-2 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均明顯增加 （P＜0.05）。

圖4 各組腦組織Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的比較

表9 各組腦組織Bax和BCL-2 mRNA表達(dá)水平比較（s）

表9 各組腦組織Bax和BCL-2 mRNA表達(dá)水平比較（s）

組 別 n Bax（mRNA） BCL-2（mRNA）Sham 10 IRI 10 1.00±0.10 1.00±0.05 3.94±0.32*0.44±0.05*TSN 101.85±0.12△0.78±0.04△

3 討 論

腦缺血再灌注損傷是腦組織供血中斷后，重新恢復(fù)腦組織血流灌注導(dǎo)致腦組織損傷反而進(jìn)一步加重的臨床危象［1-2］。其往往好發(fā)于腦外傷，心臟體外大循環(huán)手術(shù)，心臟移植和休克等。其發(fā)病率高，預(yù)后奇差［3-4］。如何預(yù)防以減輕腦缺血再灌注損傷成為臨床迫切要解決的緊迫問題。最近研究發(fā)現(xiàn)，腦組織缺血可誘發(fā)機(jī)體細(xì)胞缺血缺氧，從而導(dǎo)致機(jī)體ATP合成減少，引發(fā)炎癥反應(yīng)和促凋亡信號途徑激活，但腦組織血流灌注恢復(fù)后，反而進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)和促凋亡信號途徑激活，這導(dǎo)致大量神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，壞死，進(jìn)一步加劇腦組織損傷［5-6］。因此削弱炎癥反應(yīng)和促凋亡信號通路激活是減輕腦缺血再灌注損傷的有效干預(yù)措施。

表10 各組腦組織Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)比較（s）

表10 各組腦組織Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)比較（s）

組 別 n Bax/β-actin BCL-2/β-actin Sham 10 IRI 10 0.21±0.02 0.38±0.03 0.44±0.01*0.10±0.02*TSN 100.25±0.02△0.21±0.03△

《吳普本草》有記載傳統(tǒng)中藥丹參具有活血化瘀、涼血通經(jīng)之效，在臨床上被用于心腦血管等疾病的治療［4］，丹參酮ⅡA是其的有效成分之一，進(jìn)來研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA有抗炎、抗凋亡、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤及抗氧化應(yīng)激等生物學(xué)活性［8-9］，而炎癥和凋亡在誘發(fā)加劇腦缺血再灌注損傷起重要作用［5-6］。實驗結(jié)果顯示丹參酮ⅡA預(yù)處理可以明顯減輕腦缺血再灌注損傷誘發(fā)經(jīng)元細(xì)胞損傷，固縮核和神經(jīng)元染色明顯增加，這提示丹參酮ⅡA可減輕腦缺血再灌注導(dǎo)致的腦組織病理結(jié)構(gòu)改變。對丹參酮ⅡA減輕腦損傷的機(jī)制中探究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可減輕促炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-6和IL-1表達(dá)，促凋亡分子Bax的減少和抗凋亡分子BCL-2的增加，這提示丹參酮ⅡA預(yù)處理可通過抑制炎癥和促凋亡信號通路的激活，進(jìn)而減輕腦缺血再灌注損傷。但丹參酮ⅡA在腦缺血再灌注損傷中抑制炎癥和凋亡信號途徑的具體機(jī)制不清。

凋亡是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制，p53為一重要的腫瘤凋亡抑制蛋白，與DNA修復(fù)，細(xì)胞周期調(diào)控及細(xì)胞凋亡有。p53可通過調(diào)控下游的Bax/BCL-2蛋白發(fā)揮其促凋亡的活性，并通過促進(jìn)p21和Bax調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。最近研究發(fā)現(xiàn)，其除具有調(diào)節(jié)凋亡的活性外，還具有抗炎的功效［10-12］。實驗結(jié)果顯示丹參酮ⅡA可抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的p53表達(dá)增加。Wnt/β-catenin信號途徑是一經(jīng)典細(xì)胞信號通路，可介導(dǎo)細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、代謝等［13-15］。cyclin D1和survivin是Wnt/β-catenin信號途徑激活的定向靶向基因［14］。最近研究顯示W(wǎng)nt//β-catenin/p53信號通路在腦缺血再灌注損傷起重要作用，發(fā)現(xiàn)Wnt/ β-catenin信號通路激活可調(diào)節(jié)p53表達(dá)［13-14］。實驗結(jié)果顯示丹參酮ⅡA可以減少Wnt/β-catenin激活，和減少Wnt/β-catenin定向靶向基因cyclin D1和survivin的表達(dá)。

綜上所述，筆者可推測丹參酮ⅡA可通過抑制炎癥和凋亡而減輕腦缺血再灌注損傷，其與抑制Wnt/βcatenin/p53信號通路激活相關(guān)。但丹參酮ⅡA除抑制Wnt/β-catenin/p53信號通路外，是否還有其他信號途徑涉及丹參酮ⅡA減輕腦缺血再灌注損傷，尚需進(jìn)一步研究。

［1］ 鄧江，王義為，張潔，等.杜仲提取物對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究［J］.藥物評價研究，2014，37（6）：498-501.

［2］ 張耀東，趙紅崗，李東亮，等.缺氧預(yù)處理對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響［J］.中國臨床研究，2014，27（3）：263-265.

［3］ 閆俊，馮娟，楊雪，等.丹參酮ⅡA的藥理作用及疾病治療的最新進(jìn)展［J］.實用藥物與臨床，2015，18（8）：972-977.

［4］ 舒菁菁，李菲，董雅芬，等.丹參素藥理作用及機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)實踐雜志，2012，30（4）：266.

［5］ 武彩霞，劉睿，杜冠華.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與腦缺血/再灌注損傷［J］.中國藥理學(xué)通報，2013，29（5）：601-605.

［6］ 陳素輝，孫華，徐虹.針刺、中藥對腦缺血炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響［J］.針灸臨床雜志，2011，27（5）：69-72.

［7］ Liu G，Wang T，Wang T，et al.Effects of apoptosis-related proteins caspase-3，Bax and Bcl-2 on cerebral ischemia rats［J］.Biomed Rep，2013，1（6）：861-867.

［8］ 盧乙眾，李合華，盧奕帆.丹參酮Ⅱ聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)腦梗死后的神經(jīng)再生［J］.中國組織工程研究，2016，20（23）：3425-3431.

［9］ 黎洪展，呂永恒，陳琪，等.丹參酮ⅡA對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制［J］.中國綜合臨床，2012，28（1）：55-57.

［10］Amelio I，Melino G.The p53 family and the hypoxia-inducible factors（HIFs）：determinantsofcancerprogression［J］. Trends Biochem Sci，2015，40（8）：425-434.

［11］Lin HY，Glinsky GV，Mousa SA.Thyroid hormone and antiapoptosis in tumor cells［J］.Oncotarget，2015，6（17）：14735-14743.

［12］de Oliveira GA，Rangel LP，Costa DC，et al.Misfolding，Aggregation，and disordered segments in c-Abl and p53 in human cancer［J］.Front Oncol，2015，5：97.

［13］Zhang X，Lou Y，Zheng X，et al.Wnt blockers inhibit the proliferation of lung cancer stem cells［J］.Drug Des Devel Ther，2015，9（6）：2399-2407.

［14］Yin X，Wang X，Hu X，et al.ERβ Induces the differentiation of cultured osteoblasts by both Wnt/β-catenin signaling pathway and estrogen signaling pathways［J］.Exp Cell Res，2015；335（1）：107-114.

［15］Shan BE，Wang MX，Li RQ，et al.Quercetin inhibit human SW480 colon cancer growth in association with inhibition of cyclin DI andsurviuin expressin through Wnt/beta-catenin signaling pathway［J］.Cancer Invest，2009，27（6）：644-612.

R285.5

A

1004-745X（2016）12-2283-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.12.022

2016-07-05）

△通信作者（電子郵箱：zhouqian89f@163.com）