高麗娟劉 莉劉華生王科軍張瑩瑩△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040；3.濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺 264003）

·研究報告·

胰泰復(fù)方對胰腺纖維化大鼠氧化應(yīng)激的影響*

高麗娟1，2劉 莉1劉華生2王科軍3張瑩瑩1△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040；3.濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺 264003）

目的觀察胰泰復(fù)方對慢性胰腺炎胰腺纖維化大鼠氧化應(yīng)激的影響。方法 60只大鼠按隨機數(shù)字表法分成胰泰復(fù)方低劑量組（中低組）、胰泰復(fù)方中劑量組（中中組）、胰泰復(fù)方高劑量組（中高組）、清胰利膽顆粒組（中對組）、空白組、模型組6組，每組10只。除空白組外其余各組腹腔注射13.3%L-精氨酸，空白組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，造模后灌胃，各組給予相應(yīng)治療30 d。治療結(jié)束后血清學(xué)檢測超氧化物歧化酶中高組、丙二醛（MDA）。結(jié)果與模型組相比，各組SOD水平均有所升高（P＜0.05或P＜0.01）；中中組高于中高組、中低組（P＜0.05或P＜0.01），與中對組無差異（P＞0.05）。與模型組相比，中中組、中對組MDA水平顯著下降（P＜0.01）；中中組高于中高組、中低組P＜0.05）。結(jié)論調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激可能是胰泰復(fù)方治療慢性胰腺炎胰腺纖維化的作用機理之一。

慢性胰腺炎 胰泰復(fù)方 氧化應(yīng)激 胰腺纖維化

慢性胰腺炎（CP）的病因較復(fù)雜，常見的有長期酗酒或膽道疾病，急性胰腺炎反復(fù)發(fā)作，急性炎癥感染等，其典型病理表現(xiàn)為炎性細胞浸潤、腺泡細胞萎縮、胰管結(jié)石、胰管擴張或狹窄及胰腺實質(zhì)纖維化，最終引起胰腺功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生持續(xù)性或不可逆性損害。大量研究表明氧化應(yīng)激在肝、腎、肺纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色［1-6］，但在胰腺纖維化中研究較少［7］。本課題組長期從事胰腺纖維化的研究，前期已用L-精氨酸成功制備大鼠胰腺纖維化動物模型，在血清學(xué)、病理組織形態(tài)學(xué)已做了一定的研究與報道。本次研究通過觀察氧化應(yīng)激敏感指標超氧化物歧化酶 （SOD）、丙二醛（MDA）的表達變化，進一步探討胰泰復(fù)方對CP胰腺纖維化的防治作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（180±20）g，許可證編號：黑動字第P0010200A，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。將60只大鼠按隨機數(shù)字表法分為胰泰復(fù)方低劑量組（中低組）、胰泰復(fù)方中劑量組（中中組）、胰泰復(fù)方高劑量組（中高組）、清胰利膽顆粒組（中對組）、空白組、模型組等6組，每組10只。

1.2 藥劑與儀器 胰泰復(fù)方由黨參、柴胡、紅花、桃仁、茯苓、當歸、白術(shù)組成，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中草藥局提供。將全部藥物用8倍量水浸泡4 h，加熱煎煮l h，濾出藥液，藥渣再加6倍水，煎煮l h，再次過濾，2次濾液合并，濃縮成濃度為1∶1（即1 mL水煎劑含1 g生藥）的水煎劑。清胰利膽顆粒（國藥準字Z22020944）由長春銀諾克藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。主要試劑：L-精氨酸由上?？到萆锟萍及l(fā)展有限公司生產(chǎn)。丙二醛（MDA）測定試劑盒由南京建成生物科技有限公司提供；超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒由南京建成生物科技有限公司提供。主要儀器：F50酶標儀由上海迪奧生物科技有限公司提供。

1.3 造模與給藥 用0.9%氯化鈉注射液配置13.3% L-精氨酸溶液，除空白組外各組大鼠10 d內(nèi)左下腹腔注射13.3%L-精氨酸3次，按大鼠2 g/kg體質(zhì)量給藥計算，每隔3 d給藥1次，每次分2次給藥，空白組用等量的0.9%氯化鈉注射液行左下腹腔注射［8］。第11日開始灌胃，按正常成人與大鼠給藥劑量系數(shù)折算：中中組為11.16 g/kg；中高組為22.32 g/kg，即中中組劑量的2倍；中低組為5.58 g/kg，即中中組劑量的1/2倍；中對組為2.678 g/kg；模型組、空白組用等量0.9%氯化鈉注射液，每日1次，持續(xù)30 d。

1.4 觀察指標 每組選取8只，通過眼球取血，4℃離心機3000 min離心10 min。取上清分裝放置在-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。用于血清淀粉酶，血清SOD、MDA的檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料采用單因素方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清淀粉酶的比較 見表1。實驗結(jié)果顯示，與空白組比較模型組動物血清淀粉酶顯著增高（P<0.05或P<0.01），各給藥組對模型組動物血清淀粉酶具有降低作用。

2.2 各組大鼠血清SOD、MDA的比較 見表2。實驗結(jié)果顯示，與空白組比較模型組動物血清SOD、MDA顯著增高（P<0.05或P<0.01），各給藥組對模型組動物血清SOD和MDA具有降低作用。

3 討 論

氧化應(yīng)激（OS）是指在有害刺激作用下，機體內(nèi)的氧化作用和抗氧化防御作用關(guān)系失衡，傾向于氧化作用，機體對氧化產(chǎn)物的清除能力不足，導(dǎo)致過多的氧化產(chǎn)物產(chǎn)生及堆積，從而導(dǎo)致組織、細胞損傷的一種狀態(tài)?；钚匝酰≧OS）是過氧化氫（H2O2）、輕自由基（OH-）和超氧陰離子（O2-）等活性含氧化合物的總稱。在生理狀態(tài)下機體細胞產(chǎn)生的低水平ROS，參與了基因表達、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖、衰老及死亡等眾多生物學(xué)功能。在病理狀態(tài)下，ROS產(chǎn)生過多，超出細胞抗氧化能力，引起氧化應(yīng)激，蓄積在體內(nèi)的ROS引起的組織、細胞和機體的損傷。

表1 各組大鼠血清淀粉酶比較（s）

表1 各組大鼠血清淀粉酶比較（s）

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；各治療組與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；中高組、中中組、中低組與中對組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；中高組、中低組與中中組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01。

組別 n空白組 8模型組 8中對組 8血清淀粉酶（U/L）1039.26±140.79 2256.63±138.76**1736.77±287.76**△△中高組 8 1945.50±240.14**△?！裰兄薪M 8 1605.65±150.54**△△中低組 8 1743.70±175.46**△△

表2 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較（s）

表2 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較（s）

與空白組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與中低組比較，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；與中高組比較，■P＜0.05，■■P＜0.01。

組別 n空白組 8模型組 8中對組 8中高組 8中中組 8中低組 8 SOD（U/mL） MDA（mmol/mL）174.74±13.17 3.53±1.16 120.41±8.68▲▲7.66±1.48▲▲134.03±10.63▲▲★■6.45±1.82▲▲■■154.67±16.92▲▲★★◆◆■5.07±1.61▲**◆■139.69±12.30▲▲★★6.47±0.97▲▲148.30±7.28▲▲★★◆5.12±0.84▲**

SOD是體內(nèi)清除氧化過程中自由基的主要酶，具有超強抗氧化作用。SOD活力的測定間接地反映機體清除氧自由基的能力。SOD活性增加，從而清除氧自由基，阻止氧自由基產(chǎn)生的一系列反應(yīng)，防止細胞免損。機體內(nèi)產(chǎn)生的ROS、超氧陰離子等氧自由基與細胞膜上的多價不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。脂質(zhì)過氧化可直接損傷細胞膜從而導(dǎo)致細胞死亡。MDA為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，MDA含量測定的反映機體組織脂質(zhì)過氧化程度，也間接反映組織細胞氧化應(yīng)激損傷的程度［9］。

許多學(xué)者［10-13］采用不同方法構(gòu)建纖維化大鼠模型，檢測均發(fā)現(xiàn)大鼠組織內(nèi)SOD活性降低，MDA含量增加。由此可見氧化應(yīng)激可能是組織纖維化的發(fā)生機制之一。張曉芹等運用柴胡疏肝散通過抗氧化應(yīng)激機制，達到防治CP纖維化的作用［14］。Ryu等發(fā)現(xiàn)高糖活化PSCs過程中發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時膠原蛋白、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）等表達增加［15］。氧化應(yīng)激可能通過轉(zhuǎn)化生長因子β-1及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）導(dǎo)致纖維化的發(fā)生與進展。

血清淀粉酶是急性胰腺炎的重要生化指標，其含量升高直接反映腺泡細胞損傷。CP時腺泡細胞大量受損，血清淀粉酶生成明顯減少。但其活性仍增高，雖升高程度低于急性胰腺炎期，但仍是診斷CP的重要指征。本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠血清淀粉酶明顯升高，說明造模時胰腺受損，同時，各治療組的血清淀粉酶明顯低于模型組，說明胰泰復(fù)方對SD大鼠CP胰腺腺胞損傷有明顯的治療作用。

中醫(yī)學(xué)認為脾為氣血生化之源，脾虛中氣失健，氣血不足則肝失濡養(yǎng)，肝疏泄不利，氣機郁滯，氣滯則血瘀，故脾虛肝郁氣滯日久導(dǎo)致血瘀。CP的主要病機是本虛標實，本虛即脾虛，標實即氣滯血瘀。故本課題組依據(jù)健脾疏肝活血的原則，以四君子湯合復(fù)元活血湯化裁合成胰泰復(fù)方，適用于脾虛氣滯血瘀證的CP患者。方中，人參、白術(shù)、茯苓為君，具有健脾益氣的功效；柴胡、桃仁、當歸為臣藥，可疏肝活血止痛；佛手、郁金、紅花為佐藥，以達理氣活血的目的；炙甘草為使藥，補氣、調(diào)和諸藥。諸藥共奏健脾益氣、行氣活血之功。

本研究顯示，與模型組相比，治療后中中組、中低組、中高組大鼠SOD水平均有所升高，說明胰泰復(fù)方能夠提高大鼠血清中SOD含量，顯著增強機體抗氧化能力。給藥4周后，中中組血清MDA含量顯著降低，說明胰泰復(fù)方可以使處于缺氧狀態(tài)下的血管內(nèi)皮細胞功能得以改善，抑制脂質(zhì)發(fā)生過氧化，進而降低MDA生成量。本研究顯示，通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激可能是胰泰復(fù)方治療CP胰腺纖維化的作用機理之一。

（注：高麗娟為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合博士后科研流動站在站研究人員）

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Effect of Yi-Tai Compound Prescription on Oxidative Stress of Chronic Pancreatitis Rats with Pancreatic Fibrosis

GAO Lijuan，LIU Li，LIU Huasheng，et al. The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150040，China.

Objective：To observe the effect of Yi-Tai compound prescription on oxidative stress of chronic pancreatitis rats with pancreatic fibrosis.Methods：60 rats were divided into 6 groups i.e.Yi-tai compound prescription group of low dose，medium dose and high dose，Qingyi Lidan particle group，model group and control group. The rats of the rest groups were injected with 13.3%L-arginine.The rats in the control group were injected with saline.Rats were lavaged after modeling.And each group received corresponding treatment for 30 days.Serological tests were made on SOD and MDA after the treatment.Results：Compared with model group，SOD of all treatment groups was increased（P＜0.05 or P＜0.01）.The SOD level of the group of medium dose was higher than the SOD level of the high and low dose（P＜0.05 or P＜0.01），and was not different with Qingyi Lidan particle group（P＞0.05）.Compared with model group，the MDA level of the group of medium dose and Qingyi Lidan particle group was decreased significantly（P＜0.01）.The level of MDA in the group of medium dose was higher than the level of MDA in the high and low dose group（P＜0.05）.Conclusion：The compound prescription of Yi Tai can prevent and treat pancreatic fibrosis of chronic pancreatitis by controlling oxidative stress.

Chronic Pancreatitis；Compound Prescription of Yi Tai；Oxidative Stress；Pancreatic Fibrosis

R285.5

A

1004-745X（2016）12-2232-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.12.008

2016-09-11）

黑龍江省自然科學(xué)基金資助項目（D2005-37）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)?？蒲谢鹳Y助項目（2014bs08）

△通信作者（電子郵箱：sinogaoli@163.com）