藺曉源劉 丹曾 勇

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

·研究報(bào)告·

復(fù)方七芍降壓片保護(hù)自發(fā)性高血壓大鼠血管內(nèi)皮損傷的作用研究*

藺曉源1，2劉 丹1曾 勇1

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的探討復(fù)方七芍降壓片保護(hù)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）血管內(nèi)皮損傷的作用機(jī)制。方法 將30只SHR大鼠根據(jù)體質(zhì)量按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、復(fù)方七芍降壓片組和厄貝沙坦片組，每組各10只。另取10只Wistar-kyoto（WKY）大鼠為正常組；給藥6周后，采用ELISA檢測(cè)血清中生長(zhǎng)素（Ghrelin）、一氧化氮合酶（NOS）和內(nèi)皮素-1（ET-1）的含量變化，RT-PCR測(cè)定胸主動(dòng)脈Ghrelin受體（GHSR）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的mRNA表達(dá)。結(jié)果模型組血清Grelin、NOS含量和胸主動(dòng)脈GHSR、eNOS mRNA表達(dá)降低，血清ET-1含量升高，與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。復(fù)方七芍降壓片組和厄貝沙坦組上述指標(biāo)均較模型組有不同程度的改善 （P＜0.05或P＜0.01），且復(fù)方七芍降壓片組對(duì)血清Ghrelin、NOS、ET-1含量和胸主動(dòng)脈eNOS mRNA表達(dá)的影響優(yōu)于厄貝沙坦組（P＜0.05）。結(jié)論復(fù)方七芍降壓片可能通過調(diào)節(jié)Ghrelin、NO、ET-1含量及GHSR、NOS的基因表達(dá)而起保護(hù)SHR大鼠血管內(nèi)皮損傷的作用。

復(fù)方七芍降壓片 自發(fā)性高血壓大鼠 生長(zhǎng)素 血管內(nèi)皮活性物質(zhì)

近年來隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展和深化，人們認(rèn)識(shí)到原發(fā)性高血壓（EH）患者存在內(nèi)皮依賴性血管舒張功能失調(diào)。因而逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮功能已成為EH治療的新靶點(diǎn)，尋找具有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的藥物則成為治療的關(guān)鍵。生長(zhǎng)素（Ghrelin）是內(nèi)源性生長(zhǎng)激素促分泌素受體（GHSR）的內(nèi)源性配體，對(duì)心血管系統(tǒng)具有直接作用，能明顯降低血壓水平［1］。目前Ghrelin與EH發(fā)生發(fā)展的相互關(guān)系已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一，而對(duì)于Ghrelin在EH血管內(nèi)皮功能中的具體作用如何，尚存在爭(zhēng)議。針對(duì)EH“虛、瘀、風(fēng)”的中醫(yī)病機(jī)，采用養(yǎng)陰柔肝、化瘀息風(fēng)的復(fù)方七芍降壓片干預(yù)，能安全有效地降低患者血壓、改善臨床癥狀［2］。因此，為了進(jìn)一步探討復(fù)方七芍降壓片治療EH的作用機(jī)制，我們觀察了其對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）大鼠Ghrelin及血管內(nèi)皮活性物質(zhì)一氧化氮合酶（NOS）和內(nèi)皮素（ET-1）的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 8周齡SPF級(jí)SHR大鼠30只、Wistarkyoto（WKY）大鼠10只，雄性，體質(zhì)量240~280 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司 ［SCXK（滬）2012-0002］提供。

1.2 藥物 復(fù)方七芍降壓片（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑科生產(chǎn)，規(guī)格：0.4 g/片），以蒸餾水配置成濃度為43.2 mg/mL的混懸液；厄貝沙坦片（安來，浙江華海藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030016，規(guī)格：75 mg/片），用蒸餾水配置成濃度為1.52 mg/mL的混懸液。

1.3 試劑與儀器 大鼠Grelin、NOS、ET-1 ELISA試劑盒 （美國(guó)RD公司），YBR Green PCR試劑盒（KAPA Biosystems），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA）。Enspire多功能酶標(biāo)儀 （美國(guó)Perkinelmer），Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng) （美國(guó)Bio-rad），Realplex2熒光定量PCR儀（德國(guó)Eppendorf），Lynx6000落地式高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher），Pureloab Classic UVF超純水儀 （法國(guó)ELGA Labwater）。

1.4 分組與給藥 將SHR大鼠根據(jù)體質(zhì)量按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、復(fù)方七芍降壓片組和厄貝沙坦組，每組10只，另設(shè)WKY大鼠為正常組。復(fù)方七芍降壓片組動(dòng)物灌胃復(fù)方七芍混懸液，厄貝沙坦組動(dòng)物灌胃厄貝沙坦混懸液，灌胃劑量均為10 mL/kg，其他兩組灌胃等容量蒸餾水。給藥6周。

1.5 標(biāo)本采集 各組大鼠末次給藥后10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉，置于冰盒上真空采血管心臟取血，4℃離心（3000 r/min）15 min，取上層血清置-20℃冰箱保存。取血后，迅速剪取小段胸主動(dòng)脈組織，置于凍存管放入液氮中保存。

1.6 指標(biāo)檢測(cè) 1）ELISA檢測(cè)血清中 Grelin、NOS、ET-1的含量變化，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行。2）RT-PCR測(cè)定胸主動(dòng)脈GHSR、eNOS的mRNA表達(dá)，取待測(cè)組織，Trizol法進(jìn)行總RNA提取和純度分析。合成cDNA第一條鏈，將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，基因引物GHSR上游5'-CTACGCCACGGTCCTCA-3'、下游5'-CTTCACGCGGCCCTTA-3'，eNOS上游5'-CGGCATCACCAGGAAGAAGA-3'、下游5'-CATGAGCGGCGGAGAT-3'，內(nèi)參基因 β-Actin引物上游 5'-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3'、下游5'-TAGGAGC C AGGGCAGTA-3'。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件qbase plus進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清Grelin、NOS、ET-1含量比較 見表1。模型組大鼠血清Grelin、NOS含量降低、ET-1含量升高，與正常組比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。復(fù)方七芍降壓片組和厄貝沙坦組血清Grelin、NOS水平升高，ET-1水平降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），且復(fù)方七芍降壓片組優(yōu)于厄貝沙坦組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清Grelin、NOS、ET-1含量變化比較（s）

表1 各組大鼠血清Grelin、NOS、ET-1含量變化比較（s）

與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與厄貝沙坦組比較，＃P＜0.05。下同。

2.2 各組大鼠胸主動(dòng)脈GHSR、eNOS mRNA表達(dá)比較 見表2。模型組胸主動(dòng)脈GHSR、eNOS mRNA表達(dá)均較正常組降低（P＜0.05或P＜0.01）；復(fù)方七芍降壓片和厄貝沙坦均能上調(diào)GHSR、eNOS的mRNA表達(dá)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05或P＜0.01），且復(fù)方七芍降壓片對(duì)eNOS的表達(dá)優(yōu)于厄貝沙坦組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠胸主動(dòng)脈GHSR、eNOS mRNA表達(dá)變化比較（s）

表2 各組大鼠胸主動(dòng)脈GHSR、eNOS mRNA表達(dá)變化比較（s）

3 討 論

2005年美國(guó)高血壓學(xué)會(huì)（ASH）提出了高血壓的新定義，改變了以往對(duì)于高血壓僅從單純的數(shù)值判斷的標(biāo)準(zhǔn)，而是將概念擴(kuò)展到了總的心血管危險(xiǎn)因素，包括動(dòng)脈粥樣硬化、內(nèi)皮細(xì)胞功能損害、高脂血癥和心血管事件等［3］。血管內(nèi)皮功能障礙在EH中普遍存在，一旦內(nèi)皮細(xì)胞受損，通過測(cè)定其分泌血管活性物質(zhì)的水平，可判斷內(nèi)皮細(xì)胞功能變化。Ghrelin是一個(gè)含有28個(gè)氨基酸的多肽，主要由胃黏膜分泌，受體分布于多種組織中，在小鼠的左心室、心房、主動(dòng)脈等部位均發(fā)現(xiàn)有GHSR的存在［4］。諸多研究表明，Ghrelin在心血管系統(tǒng)中具有廣泛的生理病理作用［1］。外周靜脈注射大劑量Ghrelin可以降低血壓而不升高心率［5］。霍昱吉等研究顯示血漿Ghrelin水平與血壓呈負(fù)相關(guān)［6］，且其基因多態(tài)性研究也證明了這一相關(guān)性的存在［7］。Ghrelin除對(duì)心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用外，Ghrelin及其受體在人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞中也有表達(dá)［8］。Ghrelin治療后血壓下降的機(jī)制可能包括通過激活內(nèi)皮功能導(dǎo)致血管舒張或?qū)ρ芷交〉闹苯幼饔茫?］?，F(xiàn)有研究推測(cè)：Ghrelin可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞死亡，增加eNOS的表達(dá)，直接誘導(dǎo)NO合成（通過NOS間接反映），從而改善內(nèi)皮功能，擴(kuò)張外周血管［10-11］；Chrelin是ET-1的內(nèi)源性拮抗劑，可顯著抑制ET-1誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷及血管收縮效應(yīng)［12］。何云等研究表明，不同EH中醫(yī)證型間內(nèi)皮活性物質(zhì)NO、ET-1存在著一定的變化規(guī)律，可作為中醫(yī)高血壓病辨證分型的客觀化指標(biāo)［13］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清Grelin、NOS含量降低、ET-1含量升高，胸主動(dòng)脈GHSR、eNOS mRNA表達(dá)下降（P＜0.05），說明Ghrelin水平與EH血管內(nèi)皮功能密切相關(guān)。

EH屬中醫(yī)學(xué)“眩暈”“頭痛”等范疇，“陰虛陽亢、瘀血阻絡(luò)”是其發(fā)病的基本病機(jī)，并可用“虛、瘀、風(fēng)”來概括，治宜治虛、治瘀、治風(fēng)相結(jié)合［14］。我們采用養(yǎng)陰柔肝、化瘀息風(fēng)立法的醫(yī)院制劑復(fù)方七芍降壓片治療效果確切。該方由三七、白芍、桑寄生、杜仲、丹參、天麻、蘿芙木、地龍、葛根、炒香附、甘草組成。方中三七活血化瘀通絡(luò)，白芍養(yǎng)陰柔肝息風(fēng)，共為君藥。桑寄生、杜仲補(bǔ)益肝腎，丹參活血祛瘀，天麻平肝息風(fēng)，均為臣藥。蘿芙木平肝清熱，地龍息風(fēng)通絡(luò)，葛根生津活血，炒香附理氣疏肝，共為佐藥。甘草為使，調(diào)和諸藥。以上11味藥合用，使陰虛得補(bǔ)、陽亢得平、脈絡(luò)得暢、髓海得濡、清竅得養(yǎng)、眩暈自止。研究表明，復(fù)方七芍降壓片能有效降低血壓，其作用機(jī)制可能與改善血液高凝狀態(tài)和逆轉(zhuǎn) SHR血管重塑有關(guān)［2，15］。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方七芍降壓片能明顯改善SHR大鼠血清Grelin、NOS、ET-1水平和胸主動(dòng)脈GHSR、eNOS mRNA表達(dá)，表明復(fù)方七芍降壓片對(duì)SHR大鼠血管內(nèi)皮的保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)Ghrelin和血管內(nèi)皮活性物質(zhì)水平密切相關(guān)。而復(fù)方七芍降壓片對(duì)血清Ghrelin、NOS、ET-1含量和胸主動(dòng)脈eNOS mRNA表達(dá)優(yōu)于厄貝沙坦組，可能與中藥復(fù)方的多靶點(diǎn)效應(yīng)有關(guān)。以上研究不但揭示了復(fù)方七芍降壓片治療EH的作用靶點(diǎn)，也為Ghrelin在血管內(nèi)皮損傷中的作用提供了一定依據(jù)。

［1］ 龐軍剛，徐新.胃饑餓素對(duì)心血管系統(tǒng)的作用［J］.中國(guó)心血管雜志，2010，15（2）：164-165.

［2］ 譚元生，鄧圣明，譚超.復(fù)方七芍降壓片治療高血壓病的臨床療效及機(jī)理研究［J］.中成藥，2004，26（1）：71-73.

［3］ 張競(jìng)之，賈會(huì)欣，張汛，等．高血壓病與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的相關(guān)性研究進(jìn)展［J］．中華中醫(yī)學(xué)雜志，2008，32（5）：377-378．

［4］ Kleinz MJ，Maguire JJ，Skepper JN，et al.Functional and immunocytochemical evidence for a role of ghrelin and des-octanoyl ghrelin in the regulation of vascular tone in man［J］．Cardiovasc Res，2006，69（1）：227-235.

［5］ Nagaya N，Kojima M，Uematsu M，et al.Hemodynamic and hormonal effects of human ghrelin in healthy volunteers［J］．Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2001，280（5）：1483-1487．

［6］ 霍昱吉，王忠，王麗，等.哈薩克族高血壓患者血漿Ghrelin水平及其相關(guān)性研究［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，10（9）：650-652.

［7］ Mager U，Kolehmainen M，Lindstrm J，et al.Association between ghrelin gene variations and blood pressure in subjects with impaired glucose tolerance［J］.Am J Hypertens，2006，19（9）：920-926.

［8］ Wang L，Chen Q，Li G，et al.Ghrelin stimulates angiogenesis via GHSR1a-dependent MEK/ERK and PI3K/Akt signal pathways in rat cardiac microvascular endothelial cells［J］. Peptides，2012，33（1）：92-100.

［9］ Okumura H，Nagaya N，Enomoto M，et al．Vasodilatory effect of ghrelin，an endogenous peptide from the stomach［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2002，39（6）：779-783．

［10］Iantorno M，Chen H，Kim JA，et al.Ghrelin has novel vascular actions that mimic PI 3-kinase-dependent actions of insulin to stimulate production of NO from endothelial cells［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2007，292（3）：756-764.

［11］Togliatto G，Trombetta A，Dentelli P，et al.Unacylated ghrelin rescues endothelial progenitor cell function in individuals with type 2 diabetes［J］.Diabetes，2010，59（4）：1016-1025.

［12］宋月霞，鐘雪蓮，韓素桂，等.貝那普利對(duì)原發(fā)性高血壓患者生長(zhǎng)素水平和內(nèi)皮功能影響的臨床研究［J］．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（1）：111-112.

［13］何云，陳曉虎.高血壓病動(dòng)脈彈性及內(nèi)皮功能和中醫(yī)證型相關(guān)性研究［J］．中國(guó)中醫(yī)急癥，2015，24（4）：647-649.

［14］藺曉源，易健，譚元生．高血壓病血瘀證與血管炎癥的關(guān)系探討［J］．中醫(yī)藥信息，2016，33（2）：27-28．

［15］雍蘇南，王順民，張穩(wěn)，等．養(yǎng)陰柔肝、化瘀息風(fēng)法對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血管重塑的影響［J］．中國(guó)中醫(yī)急癥，2015，24（10）：1696-1698.

Study on the Protective Effect of Fufangqishao Anti-hypertension Tablets on Vascular Endothelial Injury in Spontaneously Hypertensive Rats

LIN Xiaoyuan，LIU Dan，ZENG Yong. First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China.

Objective：To explore the protective effect of Fufangqishao anti-hypertension tablets（FHT）on vascular endothelial injury in spontaneously hypertensive rats.Methods：30 SHR rats were randomly divided into model group，F(xiàn)HT group and irbesartan group.Another 10 Wistar-kyoto（WKY）rats were taken as the normal group.After 6 weeks of treatment，ELISA was used to detect the levels of serum Ghrelin，NOS and ET-1.The mRNA expression of GHSR，eNOS in the thoracic aorta were measured by RT-PCR.Results：Compared with the normal group，the levels of serum Ghrelin，NOS and the mRNA expression of GHSR，eNOS in the thoracic aorta decreased，serum ET-1 content increased in the model group and the difference was statistically significant（P< 0.05 or P<0.01）.The indexes above in FHT group and irbesartan group had different degrees of improvement compared with the model group（P<0.05 or P<0.01）.The effects on serum Ghrelin，NOS，ET-1 content and eNOS mRNA expression in thoracic aorta in FHT group were better than that of irbesartan group（P<0.05）.Conclusion：FHT may regulate Ghrelin，NOS，ET-1 content and GHSR，eNOS gene expression to protect vascular endothelial injury in SHR rats.

Fufangqishao anti-hypertension tablets；Spontaneously hypertensive rats；Ghrelin；Vascular endothelial active substance

R285.5

A

1004-745X（2016）12-2220-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.12.004

2016-08-20）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81473616）；中醫(yī)內(nèi)科重大疾病防治研究及轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（ZYNK201403）