潘永梅陳志強(qiáng)

（1.河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論教研室，河北 石家莊 050200；2.河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011）

·研究報(bào)告·

活血化瘀中藥湯劑對(duì)糖尿病腎病大鼠模型腎間質(zhì)纖維化的影響*

潘永梅1陳志強(qiáng)2

（1.河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論教研室，河北 石家莊 050200；2.河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011）

目的觀察活血化瘀中藥湯劑對(duì)糖尿病腎病（DN）大鼠模型腎間質(zhì)纖維化的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法 選用健康雄性SD大鼠30只，采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)、一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)建立糖尿病SD大鼠模型，然后平分為DN模型組、活血化瘀組和厄貝沙坦組各10只，活血化瘀組選擇活血化瘀中藥湯劑灌胃服藥，厄貝沙坦組選擇厄貝沙坦溶液灌胃服藥，模型組灌服等體積0.9%氯化鈉注射液，記錄三組腎間質(zhì)纖維化相關(guān)指標(biāo)的變化情況。結(jié)果所有大鼠都造模成功，活血化瘀組與厄貝沙坦組大鼠的腎質(zhì)量都明顯低于DN模型組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)后活血化瘀組與厄貝沙坦組組大鼠BUN、Scr較DN模型組明顯降低（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)后DN模型組、活血化瘀組和厄貝沙坦組大鼠尿白蛋白排泄率（UAER）值分別為（16.32± 4.29）mg/24 h、（11.50±2.59）mg/24 h和（12.20±3.01）mg/24 h，活血化瘀組和厄貝沙坦組較DN模型組明顯降低（P<0.05）。TGF-β1主要在腎間質(zhì)區(qū)、腎小管部位及小動(dòng)脈中表達(dá)；FN主要表達(dá)在腎小球、細(xì)胞外基質(zhì)和腎小管部位。Western蛋白印跡檢測(cè)顯示活血化瘀組和厄貝沙坦組的FN和TGF-β1蛋白表達(dá)水平明顯低于DN模型組大鼠（P<0.05）。結(jié)論活血化瘀中藥湯劑能夠降低DN大鼠的腎臟肥大，提高腎功能，改善腎組織病變，通過(guò)抑制腎組織TGF-βl與FN的表達(dá)，延緩腎間質(zhì)纖維化。

糖尿病腎病 活血化瘀中藥湯劑 腎間質(zhì)纖維化 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 厄貝沙坦

糖尿病腎?。―N）是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)生率隨著糖尿病病程延長(zhǎng)而逐年增高［1］。DN在早期無(wú)特異性臨床癥狀，隨著病程的發(fā)展，可出現(xiàn)腎小球?yàn)V過(guò)率降低、蛋白尿、水腫、高血壓等癥狀，最終進(jìn)入終末期腎病，是糖尿病患者主要的死亡原因之一［2-3］。DN的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，是多條途徑與多種因素共同參與、相互作用的結(jié)果，其中腎間質(zhì)纖維化是以腎小管發(fā)生萎縮和肌纖維母細(xì)胞的積聚為特征［4-5］。研究證明高血糖代謝紊亂主要通過(guò)多元醇通路代謝增強(qiáng)、糖基化終產(chǎn)物（AGEs）的產(chǎn)生、蛋白激酶C（PKC）途徑激活3條途徑損害腎臟，直接導(dǎo)致腎功能惡化［6-7］。目前研究表明TGF-β1參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞外基質(zhì)的形成，在導(dǎo)致腎臟纖維化的病理變化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［8］；也可通過(guò)調(diào)節(jié)下游血管緊張素、細(xì)胞基質(zhì)、炎性因子等因子而加速DN的進(jìn)展［9］?，F(xiàn)代中醫(yī)臨床已證實(shí)血瘀證的發(fā)生率隨糖尿病病程的遷延而上升，已成為病程在10年以上病情控制不佳患者的普遍性證候，是DN發(fā)生的根源，是貫穿始終的病理變化。為此在治療上需要活血化瘀，比如丹參、川芎、水蛭、地龍和全蝎等具有緩解血管痙攣、抗血小板解聚、擴(kuò)張微血管、降低全血黏度等作用［10］。但由于各種原因，目前多數(shù)防治DN中藥缺乏統(tǒng)一的量化指標(biāo)，缺乏多中心、隨機(jī)對(duì)照臨床研究。本文通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討了活血化瘀中藥湯劑對(duì)糖尿病腎病大鼠模型腎間質(zhì)纖維化的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與造模 選用健康雄性SD大鼠30只，4～5周齡，體質(zhì)量140～160 g，河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（冀）2013-1-003。飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，相對(duì)濕度40%～60%，室溫保持在18～25℃。12/12 h光照黑暗循環(huán)，自由獲取食物和飲水。所有大鼠均給予高脂高糖飼料 （高脂高糖飼料配方：60%普通大鼠飼料、8%蛋黃粉、10%煉豬油、20%蔗糖、2%膽固醇）喂養(yǎng)8周。一次性腹腔注射鏈脲菌素（STZ，美國(guó)sigma公司）30 mg/kg，以連續(xù)3次非同日檢測(cè)尾靜脈血糖＞16.6 mmol/L者為DN模型大鼠建立成功。

1.2 分組及處理方法 選取DN模型大鼠30只，隨機(jī)平分為DN模型組、活血化瘀組和厄貝沙坦組各10只。活血化瘀組予活血化瘀湯劑稀釋后成按1.2 g/（kg·d）灌胃。厄貝沙坦組：給予厄貝沙坦蒸餾水稀釋后12mg/（kg·d）灌胃；DN模型組：灌胃等量0.9%氯化鈉注射液。所有大鼠均給予普通詞料喂養(yǎng)，保持籠具衛(wèi)生，進(jìn)水不受限制，持續(xù)治療6周，動(dòng)物飼料由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一采購(gòu)?；钛鲋兴庮w粒由廣東一方制藥有限公司惠贈(zèng)。組成：丹參（批號(hào)402300T，1.8 g/袋，等同于飲片10 g），川芎（批號(hào)401235T，1.3 g/袋，等同于飲片6 g），地龍（批號(hào)402044T，1.0 g/袋，等同于飲片10 g），水蛭（批號(hào)408244T，1.5 g/袋，等同于飲片3 g），全蝎 （批號(hào)406498T，1.0 g/袋，等同于飲片3 g）。厄貝沙坦片（賽諾菲制藥有限公司，批號(hào)2A368，0.15 g/片）。

1.3 觀察指標(biāo) 1）定期觀察并記錄實(shí)驗(yàn)大鼠活動(dòng)。2）實(shí)驗(yàn)6周后所有大鼠置于獨(dú)立的代謝籠中，自由飲水，留取24 h尿標(biāo)本，采用Olympus AU2700全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)與計(jì)算尿白蛋白排泄率（UAER）。3）實(shí)驗(yàn)后用10%水合氯醛溶液對(duì)大鼠腹腔注射麻醉，采頸動(dòng)脈血，室溫靜置約2 h，1500 r/min離心20 min，取上層血清，選擇全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）含量。4）腎臟標(biāo)本采集。實(shí)驗(yàn)后處死大鼠后，分離雙側(cè)腎臟，在分析天平上稱重；腎臟薄片，用4%中性甲醛固定液固定標(biāo)本，用石蠟進(jìn)行包埋，常規(guī)切片。5）Western蛋白印跡分析。取100 mg腎臟組織在液氮中研磨成粉，提取總蛋白，按照Western蛋白試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白雜交分析，兔抗大鼠纖維連接蛋白（Fn）多克隆抗體與TGF-βl購(gòu)自美國(guó)Abnova公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.00統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（s）表示，兩兩對(duì)比采用配對(duì)t檢驗(yàn)；而計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用百分比或者率表示，兩兩對(duì)比為χ2分析，多組之間的比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察 見(jiàn)表1。所有大鼠都造模成功，DN模型組：精神狀態(tài)較差，行動(dòng)遲緩，毛干枯、缺乏光澤，活動(dòng)減少；活血化瘀組和厄貝沙坦組：精神狀況較差，均出現(xiàn)了不同程度的多食、多尿、多飲。經(jīng)過(guò)稱重，活血化瘀組與厄貝沙坦組大鼠的腎質(zhì)量都明顯低于DN模型組（P<0.05）。提示DN大鼠出現(xiàn)早期腎臟肥大，而活血化瘀湯劑和厄貝沙坦具有改善DN大鼠腎臟肥大的作用。

表1 各組大鼠腎質(zhì)量比較（mg，s）

表1 各組大鼠腎質(zhì)量比較（mg，s）

與DN模型組比較，*P＜0.05。下同。

組別 n 腎質(zhì)量DN模型組 10活血化瘀組 10 1345.22±163.35 1068.93±118.56*厄貝沙坦組 101111.43±165.11*

2.2 各組大鼠生化指標(biāo)比較 見(jiàn)表2。經(jīng)過(guò)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)后活血化瘀組與厄貝沙坦組大鼠BUN、Scr均較DN模型組明顯降低（P<0.05）。提示DN大鼠腎臟存在顯著高灌狀態(tài)，活血化瘀和厄貝沙坦能夠改善DN高灌注狀態(tài)。

表2 各組大鼠生化指標(biāo)比較（s）

表2 各組大鼠生化指標(biāo)比較（s）

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2.3 各組大鼠UAER水平比較 見(jiàn)表3。經(jīng)過(guò)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)后活血化瘀組和厄貝沙坦組UAER水平均較DN模型組明顯降低（P<0.05）。提示DN大鼠常出現(xiàn)大量蛋白尿，中藥活血化瘀可以延緩蛋白尿進(jìn)展。

表3 各組大鼠UAER水平比較（mg/24 h，s）

表3 各組大鼠UAER水平比較（mg/24 h，s）

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2.4 各組大鼠腎組織纖維化指標(biāo)比較 見(jiàn)表4。經(jīng)過(guò)檢測(cè)，TGF-β1主要在腎間質(zhì)區(qū)、腎小管部位及小動(dòng)脈中表達(dá)；FN主要表達(dá)在腎小球、細(xì)胞外基質(zhì)和腎小管部位。Western蛋白印跡檢測(cè)顯示活血化瘀組和厄貝沙坦組的FN和TGF-β1蛋白表達(dá)水平明顯低于DN模型組大鼠（P<0.05）。DN大鼠可導(dǎo)致FN和TGF-β1表達(dá)升高，而中藥活血化瘀能抑制FN和TGF-β1的表達(dá)。

表4 各組大鼠腎組織纖維化指標(biāo)比較（%，s）

表4 各組大鼠腎組織纖維化指標(biāo)比較（%，s）

組別 n TGF-β1 FN DN模型組 10活血化瘀組 10 7.35±0.98 6.39±1.10 1.92±0.34*2.19±0.44*厄貝沙坦組 101.89±0.45*2.61±0.41*

3 討 論

DN是糖尿病常見(jiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥之一，DN的發(fā)生將增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是糖尿病患者的主要死因之一，也是糖尿病患者腎功能衰竭的主要原因［11］。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其病變主要是逐漸的和不可逆轉(zhuǎn)的腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致腎功能衰竭［12］。

DN腎間質(zhì)纖維化特征性病理改變?yōu)橄的U(kuò)張、腎小球基底膜增厚、早期腎小球系膜細(xì)胞（GMCs）增殖、系膜外基質(zhì)（ECM）過(guò)度積聚，最終導(dǎo)致腎功能衰竭［13］。當(dāng)前研究表明高血糖、高血脂等多種代謝紊亂刺激GMCs增殖和基質(zhì)蛋白代謝失衡，導(dǎo)致ECM沉積，引起并加重DN病變進(jìn)展［14］。在藥物治療中，厄貝沙坦為血管緊張素Ⅲ型受體（ATl）拮抗劑（ARB），其可在受體水平完全阻斷AngⅡ的作用，并可通過(guò)升高血漿AngⅡ水平，阻止尿微量蛋白的排出增加［15］。在活血化瘀中藥湯劑中，丹參活血祛瘀，可消散瘀滯之血，具有“止血不留瘀”的優(yōu)勢(shì)。現(xiàn)代藥理研究表明，丹參能降血脂、抑制血栓形成，還能抗血小板凝聚及調(diào)節(jié)內(nèi)外凝血系統(tǒng)的功能。川芎活血行氣，為血中之氣藥。與丹參配伍，相須為用，加強(qiáng)其活血之力。水蛭入血分，《本經(jīng)》云其“主逐惡血、瘀血，破血瘕積聚”?，F(xiàn)代研究表明，水蛭能阻止凝血酶對(duì)纖維蛋白原的作用，阻礙血液凝固；還能活化纖溶系統(tǒng)，促進(jìn)已形成血栓溶解。全蝎性善通竄，能攻毒散結(jié)，通絡(luò)止痛?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有抗凝、抗血栓形成、促纖溶等作用。地龍長(zhǎng)于通行經(jīng)絡(luò)，具有溶栓和抗凝作用，可明顯延長(zhǎng)血小板血栓和纖維蛋白血栓形成時(shí)間。水蛭、全蝎、地龍皆為中藥中的常用蟲(chóng)類通絡(luò)藥，性善走竄，三藥合用，可剔邪通絡(luò)。綜觀全方，活血化瘀通絡(luò)，切中病機(jī)，組方科學(xué)、配伍嚴(yán)謹(jǐn)；諸藥合用，則腎絡(luò)瘀阻可消［16］。本研究腎組織形態(tài)學(xué)觀察顯示，DN大鼠腎小球體積增大，而在活血化瘀中藥與厄貝沙坦治療后，腎臟肥大的病理改變明顯改善。

蛋白尿是DN最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)，它既是腎臟疾病的結(jié)果，也是參與DN的致病因素。尿蛋白可直接損傷系膜細(xì)胞，促進(jìn)系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生，形成異常的蛋白質(zhì)，使纖維細(xì)胞增生，從而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生［17］。并且蛋白尿的形成是與腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變導(dǎo)致的系膜基質(zhì)擴(kuò)展、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、足細(xì)胞損傷和基底膜增厚等腎間質(zhì)纖維化病理改變密切相關(guān)［18］。瘀濁阻滯是DN的主要病理產(chǎn)物，伴隨著中西醫(yī)結(jié)合治療日新月異的發(fā)展，中藥在治療DN方面也具有其獨(dú)特的價(jià)值。活血化瘀類中藥如丹參、川芎、水蛭、地龍和全蝎等具有擴(kuò)張微血管、緩解血管痙攣、抗血小板聚集、降低全血黏度等作用。相關(guān)研究表明丹參可調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能，對(duì)機(jī)體非特異性免疫功能和特異性體液免疫功能具有調(diào)理作用；血塞通片提取物能夠清除氧自由基，抑制過(guò)氧化物產(chǎn)生，對(duì)腎缺血再灌注損傷有預(yù)防和保護(hù)作用［19-20］。本研究也表明活血化瘀類中藥能通過(guò)降低蛋白尿進(jìn)而阻止DN的發(fā)展。同時(shí)本研究還表明活血化瘀中藥能夠改善肌酐清除率，具有腎臟保護(hù)作用。

腎間質(zhì)纖維化是以ECM成分代謝失衡、ECM積聚，基底膜增厚為特征。ECM主要由纖維連接蛋白（Fn）、膠原蛋白、層粘連蛋白等組成。同時(shí)細(xì)胞因子在DN發(fā)病中的作用不容忽視，涉及到腎小球血流動(dòng)力學(xué)改變、細(xì)胞增殖和細(xì)胞肥大等諸多方面［21］。TGF-β1是已知致腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子，能抑制腎近曲小管上皮細(xì)胞、腎小球臟層上皮細(xì)胞和腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)基底膜增厚，促進(jìn)腎小球硬化；也可通過(guò)干擾正常細(xì)胞周期，誘導(dǎo)產(chǎn)生周期素依賴蛋白激酶抑制劑，進(jìn)而抑制其激活，導(dǎo)致腎纖維化［22］。有研究證實(shí)水蛭可減輕大鼠的腎纖維化，地龍和全蝎能夠抑制AGEs誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1表達(dá)［23］。我們采用免疫組化法和免疫印跡法對(duì)SD大鼠腎組織FN和TGF-β1進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DN模型大鼠腎組織FN和TGF-β1的表達(dá)明顯增加，活血化瘀中藥與厄貝沙坦治療6周顯著降低FN和TGF-β1的表達(dá)水平。當(dāng)前也有研究表明川芎嗪可減少免疫復(fù)合物的沉積，減輕足細(xì)胞損傷，有助于減輕系膜增生導(dǎo)致的腎小球硬化，能很好地改善腎功能，抗腎臟纖維化［4］。

總之，活血化瘀中藥湯劑能夠改善DN大鼠的腎臟肥大，提高腎功能，改善腎組織病變，通過(guò)抑制腎組織TGF-βl與Fn的表達(dá)，延緩腎間質(zhì)纖維化。

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Effects of Huoxue Huayu Decoction on Kidney Interstitial Fibrosis in Diabetic Nephropathy Rats'Model

PAN Yongmei，CHEN Zhiqiang. Department of Basic Theory of Traditional Chinese Medicine of Basic Medical College，Hebei University of Chinese Medicine，Hebei，Shijiazhuang 050200，China.

Objective：To observe the effects of Huoxue Huayu decoction on kidney interstitial fibrosis in diabetic nephropathy rats'model to explore its possible mechanism.Methods：From January 2015 to July 2015，30 clean grade healthy male Sprague Dawley rats were fed with high glucose and high fat diet and injected with streptozotocin（STZ）for inducing diabetic SD rats'model，and then were equally divided into DN model group，irbesartan group and Huoxue Huayu group with 10 rats in each group.The Huoxue Huayu group was given Huoxue Huayu decoction by intragastric administration，the irbesartan group was given irbesartan solution by intragastric administration，the DN model group was fed with normal saline of the same volume，and the changes on the renal interstitial fibrosis related indexes were recorded in the three groups.Results：All rats were successfully modeled.The rat kidney weight in the Huoxue Huayu group and irbesartan group were significantly lower than that of the DN model group（P<0.05）.After the experiment，the serum BUN and Scr level in the Huoxue Huayu group and irbesartan group were significantly lower than that of the DN model group（P<0.05）.After the experiment，the rats'UAER in the DN model group，Huoxue Huayu group and irbesartan group were（16.32±4.29）mg/ 24 h，（11.50±2.59）mg/24 h and（12.20±3.01）mg/24 h.The value of Huoxue Huayu group and irbesartan group showed significant difference with the DN model group（P<0.05）.The TGF-β1 was mainly expressed in the renal interstitial region，renal tubular part and small artery，and FN was mainly expressed in the glomerular，extracellular matrix and renal tubular parts.Western blot showed that the expression level of TGF-β1 and FN protein in Huoxue Huayu group and irbesartan group were significantly lower than that of DN rats in the model group（P<0.05）. Conclusion：The traditional Chinese medicine Huoxue Huayu decoction can reduce renal hypertrophy in the dia-betic nephropathy rats，improve renal tissue condition by inhibiting the expression of TGF-β1 and Fn in renal tissue so as to delay renal interstitial fibrosis.

Diabetic nephropathy；Huoxue Huayu decoction；Renal interstitial fibrosis；Animal experiment；Irbesartan

R285.5

A

1004-745X（2016）12-2216-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.12.003

2016-09-22）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81373804）；河北中醫(yī)學(xué)院博士基金課題項(xiàng)目（BSZ2014004）