鄢雯 劉立新 夏山 王紅霞

(1.首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院，北京 101300;2.中國人民解放軍66222部隊醫(yī)院，北京 102202; 3.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100084)

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IL-6誘導(dǎo)小鼠肌原細(xì)胞系C2C12 UⅡ/UT系統(tǒng)的高表達(dá)

鄢雯1劉立新1夏山2王紅霞3△

(1.首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院，北京 101300;2.中國人民解放軍66222部隊醫(yī)院，北京 102202; 3.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100084)

目的 觀察外源給予IL-6對C2C12細(xì)胞中UⅡ/UT系統(tǒng)表達(dá)的影響。方法 培養(yǎng)小鼠肌原細(xì)胞系C2C12細(xì)胞株，應(yīng)用胎盤藍(lán)染色和測定細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的含量檢測IL-6對細(xì)胞損傷的影響，應(yīng)用放射免疫的方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液和裂解液中UⅡ的含量，應(yīng)用RT-PCR法測定C2C12中UT mRNA的表達(dá)。結(jié)果 外源給予不同濃度的IL-6，C2C12細(xì)胞裂解液中UⅡ的含量各組間無明顯差異，但增加了細(xì)胞孵育液中UⅡ的含量，10 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL時較對照組分別增加了104.9%(P<0.01)、86.4%(P<0.01)和94.3%(P<0.01)。低濃度IL-6(0.1 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL和50 ng/mL)刺激明顯增加了UT mRNA的表達(dá)，而高濃度的IL-6(100 ng/mL)刺激反而使UT mRNA的表達(dá)降低。 結(jié)論 IL-6作為T2DM發(fā)病因素之一的炎癥因子，可能是T2DM時骨骼肌組織中UⅡ/UT系統(tǒng)表達(dá)增加的因素之一。

尾加壓素Ⅱ； G蛋白偶聯(lián)受體； 白介素-6

尾加壓素Ⅱ(UⅡ)是從硬骨魚的尾部下垂體中提純的神經(jīng)肽[1]。UⅡ與其受體(UT)結(jié)合后，可參與多種生物學(xué)效應(yīng)[2-3]。2型糖尿病(T2DM)的重要特征之一是胰島素抵抗(IR)，肌肉組織是胰島素抵抗的主要靶點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)UⅡ在骨骼肌含量最高[4]。目前UⅡ和T2DM的關(guān)系亦引起了人們的重視。炎癥因子的過度激活可能是胰島素抵抗發(fā)展的一個基本步驟[5-6]，骨骼肌UⅡ/UT系統(tǒng)改變是否與炎癥因子有關(guān)？尚未見報道。本研究采用小鼠的肌原細(xì)胞系C2C12，外源給予不同濃度的白介素-6(IL-6)，觀察UⅡ/UT系統(tǒng)表達(dá)的變化，探討影響T2DM時骨骼肌中UⅡ/UT系統(tǒng)高表達(dá)的因素。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑 小鼠肌原細(xì)胞系C2C12細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所。胎牛血清和馬血清購自Gibco公司；總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；UT-S(5’-GCATCTTCACCCTGACCATAA-3’)、UT-A引物(5’-CCCAGAAGAGAAGGACGATACC-3’)[7]、β-actin-S引物(5’-ATCTGGCACCACACCTTC-3’)及β-actin-A引物(5’-AGCCAGGTCCAGACGCA-3’)[8]均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。UⅡ放射免疫測定法試劑盒購自美國Phoenix PharmacINC公司，按照說明書操作。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 待細(xì)胞長到80%融合時，用2%馬血清分化2～3 d，可見到細(xì)胞內(nèi)有明顯的肌管出現(xiàn)可用于實(shí)驗(yàn)。采用胎盤藍(lán)染色和測定LDH含量觀察IL-6對細(xì)胞的損傷；采用RT-PCR方法測定C2C12細(xì)胞中UT mRNA表達(dá)，重復(fù)3次獨(dú)立試驗(yàn)；采用放射免疫測定法測定細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞裂解液中U Ⅱ 的含量。

2 結(jié) 果

2.1 臺盼藍(lán)染色結(jié)果 臺盼藍(lán)染色是對細(xì)胞存活率比較精確的定量分析，在實(shí)驗(yàn)中給予不同濃度的IL-6后，測定臺盼藍(lán)染色陽性的細(xì)胞，以評價IL-6刺激對細(xì)胞死亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源給予不同濃度的IL-6刺激24 h，各組未見染色陽性的細(xì)胞或僅見個別染色陽性的細(xì)胞，各組間無明顯差異。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的含量 乳酸脫氫酶是代表組織或細(xì)胞受到損傷的一個指標(biāo)，在實(shí)驗(yàn)中給予不同濃度的IL-6后，測定細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的含量，以評價IL-6刺激對細(xì)胞損傷的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予不同濃度的IL-6刺激24 h，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量增高，0.1 ng/mL IL-6刺激時，培養(yǎng)液中LDH的含量為50 U/L，較對照組增高2.75倍，1 ng/mL和10 ng/mL IL-6刺激時，LDH的含量略有下降，但仍較對照組增高2倍和1.75倍，當(dāng)IL-6刺激濃度升至50 ng/mL和100 ng/mL時，培養(yǎng)液中LDH濃度出現(xiàn)明顯升高，分別為100 U/L 和159.1 U/L，較對照組分別增高5倍和8倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 IL-6增加了C2C12細(xì)胞孵育液中UⅡ的含量 與對照組相比較，外源給予不同濃度的IL-6(0.1、1、10、50、100 ng/mL)對C2C12細(xì)胞裂解液中UⅡ的含量無明顯影響，但增加了C2C12細(xì)胞孵育液中UⅡ的含量，0.1 ng/mL和1 ng/mL較對照組分別增加了13.1%和9.5%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，而10 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL時較對照組分別增加了104.9%、86.4%和94.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。見表1。

組別細(xì)胞裂解液中UⅡ含量/(pg/mgPro)細(xì)胞孵育液中UⅡ含量/(pg/mgPro)對照組160．2±41．438．9±4．00．1ng/mL152．0±35．544．0±4．21ng/mL164．9±31．742．6±3．510ng/mL157．1±8．779．7±8．1?50ng/mL130．0±32．572．5±12．3?100ng/mL138．3±28．475．6±17．8?

注：與對照組相比，*P<0.01。

2.4 不同濃度的IL-6刺激對肌原細(xì)胞系C2C12中UT mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR分析表明UT mRNA在C2C12細(xì)胞中表達(dá)，較低濃度的IL-6增加了UT mRNA的表達(dá)，不加模板的引物對照組的UT/β-actin光密度比值為(0.33±0.06)；0.1 ng/mL IL-6刺激組為(0.4±0.05)，較對照組增加了25.9%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；當(dāng)IL-6的刺激濃度升高至1 ng/mL、10 ng/mL及50 ng/mL時，細(xì)胞中UT mRNA的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯升高，UT/β-actin光密度比值分別為(0.56±0.05)、(0.62±0.06)和(0.78±0.06)，較對照組分別增加了71.8%、90.1%和138.9%(均P<0.05)；然而，100 ng/mL IL-6刺激時UT mRNA的表達(dá)水平較對照組反而降低了34.4%(P<0.05)。UT基因RT-PCR擴(kuò)增片段的電泳結(jié)果見圖2。

注：1.對照組(不加模板的引物)；2～6.分別為刺激濃度是0.1 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL IL-6的處理組。圖2 外源給予不同濃度的IL-6對C2C12細(xì)胞系中UT含量的影響

3 討 論

IR是指胰島素作用的靶器官對胰島素作用的敏感性下降。胰島素抵抗是一個慢性亞臨床炎癥過程，在這過程中胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)相互促動，引起一系列機(jī)體內(nèi)環(huán)境的改變[9]。涉及胰島素抵抗的主要靶器官包括肝臟、脂肪、肌肉等。其中肌肉組織在IR中的作用尤為重要。骨骼肌組成體質(zhì)量的40%～50%，負(fù)責(zé)靜息氧耗的20%～30%，負(fù)責(zé)生理狀態(tài)下胰島素調(diào)節(jié)的葡萄糖的處理的75%，因此也成為糖尿病及其胰島素抵抗的主要靶點(diǎn)[4,10]。2009年，我室首先報道[11]了遺傳性2型糖尿病小鼠(KKAy/Upj)骨骼肌U Ⅱ/UT系統(tǒng)上調(diào)；并在體外孵育的骨骼肌組織薄片上，觀察到U Ⅱ 呈濃度(10-9～10-7mol/L)依賴地抑制胰島素刺激的骨骼肌2-DG攝入。但什么因素影響了伴有胰島素抵抗T2DM時骨骼肌中U Ⅱ/UT系統(tǒng)的高表達(dá)并不清楚。

IL-6是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的一個重要細(xì)胞因子，它具有促炎和抗炎作用。多種細(xì)胞可產(chǎn)生IL-6，包括骨骼肌。鍛煉能夠使肌肉釋放大量的IL-6，表明IL-6在鍛煉期間和鍛煉后維持葡萄糖穩(wěn)定中具有重要的作用。但有證據(jù)[12]表明IL-6血清水平隨著年齡的增加而增加；IL-6的升高是T2DM發(fā)展的一個危險因素；在各種各樣的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)時循環(huán)中IL-6水平的升高，包括糖尿病和肥胖；大鼠在體情況下，急性IL-6處理可減少胰島素刺激的骨骼肌葡萄糖攝??；由于發(fā)現(xiàn)IL-6常常在代謝性疾病中升高，普遍認(rèn)為IL-6是慢性疾病的一個病因，是促使胰島素抵抗和高脂血癥發(fā)生的促炎因子[13]。U Ⅱ 在急慢性炎癥中具有作用，而且M.Birker[14]等培養(yǎng)人的橫紋肌肉瘤細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)IFN-γ增加UT受體表達(dá)上調(diào)。那么IL-6是否作為一個炎癥因子刺激了骨骼肌組織中U Ⅱ/UT系統(tǒng)的上調(diào)，從而進(jìn)一步引起骨骼肌胰島素抵抗的發(fā)生目前尚無文獻(xiàn)報道。

本研究在肌原細(xì)胞上觀察外源給予IL-6對U Ⅱ/UT系統(tǒng)表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)外源給予不同濃度的IL-6，用放射免疫方法測定到C2C12細(xì)胞裂解液中UⅡ的含量各組間無明顯差異，但增加了細(xì)胞孵育液中UⅡ的含量，0.1 ng/mL和1 ng/mL較對照組分別增加了13.1%和9.5%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，而10 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL時較對照組分別增加了104.9%、86.4%和94.3%，差異有顯著性(均P<0.01)。用RT-PCR的方法測定了C2C12細(xì)胞中UT mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度IL-6(1 ng/mL、10 ng/mL和50 ng/mL)刺激明顯增加了UT mRNA的表達(dá)，而高濃度的IL-6(100 ng/mL)刺激反而使UT mRNA的表達(dá)降低。以上結(jié)果表明IL-6作為T2DM發(fā)病因素之一的炎癥因子，可能是T2DM時骨骼肌組織中UⅡ/UT系統(tǒng)表達(dá)增加的一個因素；至于高濃度時IL-6抑制UT mRNA表達(dá)的原因，可能是自身的代償去拮抗UⅡ的作用，但由于高濃度IL-6增加了細(xì)胞孵育液中LDH的含量，因此不能排除是由于細(xì)胞損傷本身導(dǎo)致其UT mRNA表達(dá)的下降。

本研究首次報道了炎癥因子IL-6可能是2型糖尿病小鼠骨骼肌UⅡ/UT系統(tǒng)上調(diào)的一個因素。鑒于T2DM時引起胰島素抵抗的因素眾多，是否還有其他因素參與了其表達(dá)的升高還值得進(jìn)一步探討。

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High expression of IL-6 induced the up-regulation of UII/UT system in mouse myogenic cell line C2C12

YanWen1,LiuLixin1,XiaShan2，WangHongxia2△.

1.YanjingMedicalCollege,CapitalMedicalUniversity,Beijing101300,China. 2.ChinesePeople'sLiberationArmy66222ArmyHospital,Beijing102202,China. 3.BasicMedicalCollege,CapitalMedicalUniversity,Beijing100084,China.

Objective To observe the effect of IL-6 on the expression of UⅡ/UT system in C2C12. Methods Cell injury was determined by Placenta blue staining and LDH kit. The content of UⅡ in cell lysate and cell incubation fluid were assayed by RIA, mRNA levels were assayed by RT-PCR. Results UⅡ content in cell incubation fluid was increased after IL-6 of different concentration was administrated, the UⅡ content was increased by 104.9 %(P<0.01), 86.4 %(P<0.01)and 94.3 %(P<0.01) when the concentration of IL-6 was elevated to 10 ng/mL, 50 ng/mL and 100 ng/mL. The simulation of different concentration of IL-6 (0.1 ng/mL, 1 ng/mL, 10 ng/mL and 50 ng/mL) significantly increased the expression of UT mRNA. However, the expression of UT mRNA was decreased significantly when the concentration of IL-6 was elevated to100 ng/mL. Conclusion IL-6 might be a factor involved in up-regulating the expression of UⅡ/UT system for the skeletal muscle of Type 2 diabetes mellitus.

Urotensin Ⅱ G protein coupled receptor； Interleukin-6

北京高等學(xué)校青年英才項目(YETP1679)；首都醫(yī)科大學(xué)校自然科學(xué)基金(2014QD03)

R363

A

1000-744X(2016)03-0233-03

2015-09-21)

△通信作者，E-mail：whxdy112@ccmu.edu.cn