王耀煒 王惠芳

(西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸科，陜西 西安 710038)

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烏司他丁對(duì)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞TREM蛋白表達(dá)的影響研究

王耀煒 王惠芳

(西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸科，陜西 西安 710038)

目的 研究烏司他丁對(duì)脂多糖(lipopoly saccharide,LPS)刺激后的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞(AM)表面TREM蛋白表達(dá)的影響，并探討烏司他丁在AM介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制。方法 培養(yǎng)肺泡巨噬細(xì)胞，分為對(duì)照組、LPS干預(yù)組、LPS+烏司他丁(LU)組。對(duì)照組不予處理，LPS干預(yù)組給予100 ng/mL LPS，LU組給予100 ng/mL LPS+10 000 U/mL烏司他丁，之后分別在3 h、12 h、24 h用流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)AM表面TREM1、TREM2蛋白的表達(dá)水平。ELISA檢測(cè)AM培養(yǎng)上清液中TNF-α表達(dá)水平。結(jié)果 對(duì)照組TREM1、TREM2各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LPS干預(yù)組TREM1的表達(dá)在3 h上升到最高，24 h時(shí)接近正常；TREM2在3 h下降到最低，之后上升。LU組TREM1的表達(dá)均明顯下降，24 h下降至最低，與LPS組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TREM2的表達(dá)均明顯升高，在24 h升至最高，與LPS組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TNF-α的表達(dá)對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LPS組在3 h達(dá)到最高，之后下降，24 h時(shí)接近正常；LU組均明顯下降，與LPS組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 烏司他丁可能通過調(diào)節(jié)TREM蛋白在LPS致AM介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起重要作用。

烏司他??； 髓系細(xì)胞觸發(fā)受體； 肺泡巨噬細(xì)胞； 脂多糖

肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage,AM)是肺內(nèi)接觸抗原最早的常駐細(xì)胞,參與肺內(nèi)早期炎癥的啟動(dòng)與維持。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌外膜的主要組成部分，其可活化多種炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等,通過參與TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路促使大量炎癥因子釋放失控并產(chǎn)生放大效應(yīng),進(jìn)而打破炎癥自限機(jī)制,產(chǎn)生自身破壞性的過度炎癥反應(yīng)。

TREM家族受體是新近發(fā)現(xiàn)的一組免疫球蛋白超家族受體，多表達(dá)于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，迄今發(fā)現(xiàn)至少包括TREM1、TREM2兩個(gè)受體。AM表面正常情況下即表達(dá)TREM1、TREM2受體，在受到LPS刺激后受體表達(dá)產(chǎn)生相應(yīng)的變化分別擴(kuò)大、抑制炎癥。烏司他丁是一種廣譜蛋白酶抑制劑，具有抗氧化、清除氧自由基、抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用，既往多項(xiàng)研究[1]證實(shí)其在急性肺損傷，急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥等中有抗炎及肺保護(hù)作用。烏司他丁抗炎作用是否與AM表達(dá)的TREM受體有關(guān)尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)觀察烏司他丁干預(yù)LPS刺激后的AM并觀察其表面TREM受體的表達(dá)規(guī)律，旨在進(jìn)一步探討烏司他丁在AM介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 近交系C57BL/6小鼠，8～12周齡(北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)，抗小鼠TREM1抗體(R&D公司)，抗小鼠TREM2抗體(R&D公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗大鼠抗體(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)，LPS(德國(guó)sigma公司)，ELISA試劑盒(RB公司)，烏司他丁注射液(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 (1)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞(AM)的分離、培養(yǎng)和純化：頸椎脫臼法處死小鼠，用95%的酒精浸泡3～5 min，剪開頸部皮膚，并逐層分離致氣管。用去尖端七號(hào)針頭穿入氣管內(nèi)，絲線固定牢固。取1 mL注射器抽取磷酸鹽緩沖液(PBS)0.8 mL，并緩慢推入氣管，停留1 min后回抽，共6～8次。抽取的肺泡灌洗液(BALF)注入離心管內(nèi)離心(1 500 r/min)6 min后棄去上清液。底部的細(xì)胞沉淀用6 mL RPMI1640混勻制成單細(xì)胞懸液，等份接種在3個(gè)25 mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中過夜進(jìn)行AM的貼壁純化。次日棄去瓶中培養(yǎng)液，用0.02 %的胰蛋白酶消化貼壁的AM,用RPMI1640將消化下來的AM混勻制成單細(xì)胞懸液，高倍鏡下計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×106/mL,將其等份接種在3個(gè)12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，分為三組，對(duì)照組、LPS干預(yù)組、LU組，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各設(shè)三個(gè)復(fù)孔。(2)藥物干預(yù)：對(duì)照組不做處理，LPS干預(yù)組取100 ng/mL LPS分別加入各孔，LU組取100 ng/mL LPS+10 000 U/mL烏司他丁注射液分別加入各孔。(3)流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)AM表面TREM的表達(dá)：分別在3 h、12 h、24 h各時(shí)間點(diǎn)收集以上培養(yǎng)的三組肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CellQuest軟件分析。(4)TNF-α的檢測(cè)：收集各組各孔AM培養(yǎng)上清液,按照ELISA試劑盒說明檢測(cè)TNF-α含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以(x±s)表示,采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的單因素方差分析,各時(shí)點(diǎn)組間多重比較采用最小顯著差法,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AM表面TREM1、TREM2的表達(dá) 對(duì)照組TREM1、TREM2各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LPS干預(yù)組TREM1的表達(dá)在3 h達(dá)到最高，之后逐漸下降，24 h接近正常，3 h、12 h組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LU干預(yù)后TREM1的表達(dá)顯著下降，24 h下降至最低值，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與LPS組比較各組均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LPS干預(yù)組TREM2的表達(dá)在3 h降至最低，之后逐漸上升，24 h接近正常，3 h、12 h組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LU干預(yù)后TREM2的表達(dá)顯著上升，T24 h上升至最高值，與對(duì)照組比較T24 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LPS組比較各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

指標(biāo)組別3h12h24hTREM1對(duì)照組56.34±4.56*58.26±6.25*59.68±7.36LPS組136.58±7.48 110.37±9.6465.35±3.36LU組68.25±5.68*46.42±6.38*30.24±9.68*TREM2對(duì)照組 162.42±2.91△ 170.58±3.92△180.42±4.91 LPS組106.72±3.56 134.54±3.58166.27±6.37 LU組138.2±9.67△163.35±6.38△203.35±6.38△

注：TREM1各組、各時(shí)間點(diǎn)與LPS組比較，*P<0.05；TREM2各組、各時(shí)間點(diǎn)與LPS組比較,△P<0.05。

2.2 TNF-α的表達(dá) 對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LPS組在3 h達(dá)到最高，之后逐漸下降，24 h時(shí)接近正常。LU干預(yù)后TNF-α的表達(dá)顯著下降，24 h下降至最低值，與對(duì)照組比較24 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與LPS組比較各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

指標(biāo)組別3h12h24hTNF-α對(duì)照組7.59±0.28*8.06±1.36*9.15±1.57LPS組36.58±3.67 25.32±5.1412.79±2.16LU組10.68±1.64*7.67±2.17*4.38±1.84*

注：TNF-α各組，各時(shí)間點(diǎn)與LPS組比較,*P<0.05。

3 討 論

肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage，AM)是肺內(nèi)主要的居留性吞噬細(xì)胞，構(gòu)成呼吸系統(tǒng)防御病原微生物和其他肺損傷因素的第一道防線，既能促進(jìn)炎性反應(yīng)，又能抑制炎癥的發(fā)展[2]，它是呼吸道的免疫核心細(xì)胞，也是內(nèi)毒素(LPS)的主要效應(yīng)細(xì)胞。AM可表達(dá)多種膜受體和膜分子，如Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)、甘露糖受體等。此外，它還可分泌多種細(xì)胞因子、小分子炎性介質(zhì)、補(bǔ)體成分等，參與炎性反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)作用。TREM家族是一種新型的免疫球蛋白超家族炎癥激發(fā)受體，可以調(diào)節(jié)LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。該家族主要有TREM1、TREM2兩個(gè)成員，近年來多項(xiàng)研究表明TREM1受體具有擴(kuò)大炎癥的作用，而TREM2受體與之相反有強(qiáng)大的抗炎作用[3]。AM表面在正常情況下即表達(dá)TREM受體，在受到LPS刺激后TREM受體的表達(dá)產(chǎn)生相應(yīng)變化來應(yīng)對(duì)所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到調(diào)控炎癥反應(yīng)的目的。

烏司他丁(UTI)是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，可以抑制蛋白酶活性，也具有調(diào)控細(xì)胞因子的作用，能抑制全身炎癥反應(yīng)綜合征，從而阻止多臟器功能障礙的發(fā)生、發(fā)展。另外UTI分子中還具有與細(xì)胞膜受體識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)。Nakatani等[4]在體外實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，UTI呈劑量依賴性地抑制細(xì)胞外中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性的同時(shí)，還抑制其在細(xì)胞內(nèi)的活性和分泌，從而抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。大劑量UTI可進(jìn)一步下調(diào)炎癥因子水平，從而對(duì)膿毒癥性肺損傷起保護(hù)作用[5]。Li等[6]的研究表明UTI可以通過AMPK/NF-κB通路抑制LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷中的炎癥介質(zhì)起到肺保護(hù)作用。

UTI是否能識(shí)別AM細(xì)胞表面TREM受體，并參與調(diào)節(jié)TREM受體的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)是我們本次研究的重點(diǎn)。從研究結(jié)果來看，正常情況下AM表面即表達(dá)一定數(shù)量的TREM蛋白，且隨時(shí)間的變化無顯著改變。在受到LPS刺激后TREM1蛋白及TNF-α表達(dá)均明顯升高，而TREM2表達(dá)明顯下降，以上變化在LPS刺激后3 h點(diǎn)最明顯。用UTI干預(yù)后TREM1表達(dá)顯著下降，到24 h時(shí)下降至最低點(diǎn)，而TREM2表達(dá)均明顯上升，在24 h點(diǎn)時(shí)達(dá)到最高。從而我們分析AM在受到LPS刺激后產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)，并生成大量炎癥介質(zhì)，如TNF-α，這些炎癥介質(zhì)可能反饋調(diào)節(jié)其表面TREM蛋白的表達(dá)，使TREM1升高，TREM2下降從而調(diào)控炎癥反應(yīng)的平衡，至于是否有其他炎癥介質(zhì)的參與，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。LPS刺激后促炎因子大量表達(dá)并占據(jù)優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)TREM1的高表達(dá)會(huì)更進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響。UTI干預(yù)AM后TREM1、TNF-α的表達(dá)均明顯下降，而TREM2的表達(dá)逐漸上升，均在24 h時(shí)變化最明顯。從而我們初步推測(cè)UTI可能通過識(shí)別AM表面的TREM受體并通過調(diào)節(jié)其變化來減輕LPS對(duì)AM造成的失控性炎癥損害，具體調(diào)控機(jī)制可能是通過炎癥因及受體表達(dá)雙重調(diào)控來完成。

本實(shí)驗(yàn)中LU組隨著UTI作用AM時(shí)間的延長(zhǎng)，在24 h時(shí)TREM1、TREM2蛋白以及TNF-α的變化達(dá)到最大，考慮其抗炎效應(yīng)也隨干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，在24 h時(shí)達(dá)到最大效率。考慮其對(duì)TREM蛋白的識(shí)別以及炎癥因子的調(diào)控需要一定的時(shí)間來達(dá)到最大化。至于提高UTI干預(yù)AM的濃度后是否會(huì)對(duì)TREM蛋白表達(dá)產(chǎn)生更深影響，以及與TREM受體識(shí)別后其是通過下游哪條通路、哪些細(xì)胞因子之間相互作用來實(shí)現(xiàn)信號(hào)的傳導(dǎo)從而發(fā)揮抗炎作用，仍需要進(jìn)一步研究。

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Effect of ulinastatin for expression of TREM at alveolar macrophages in mice

WangYaowei，WangHuiFang.

DepartmentofPulmonaryDisease,theSecondAffiliatedHospitalofXianMedicalCollege,Xian710038,Shanxi,China.

ObjectiveTo investigate the effect of ulinastatin for expression of TREM after LPS stimulates the alveolar macrophages (AM) and explore mechanism in AM-mediated inflammatory response.Methods Cultured the alveolar macrophages,which were divided into control group,LPS group,and LU group.LPS group was added LPS at the final concentration of 100 μg/mL,and LU group was added LPS at the final concentration of 100μg/mL and ulinastatin the final concentration of 10 000 U/mL.The expression level of TREM1 and TREM2 at 3 h,12 h,24 h time points was detected by flow cytometry (FACS).And the concentration of TNF-α was detected by ELISA method.Results The expression of TREM1 and TREM2 at Control group there were no statistical significantly differences in other time points(P>0.05).The expression of TREM1,TREM2 and TNF-α that there were statistical significantly differences between LU and LPS group(P<0.05).The expression of TNF-α at Control group there were no statistical significantly differences in other time points(P>0.05).Conclusion Ulinastatin can adjust the TREM protein in LPS to AM-mediated inflammatory response plays an important role.

Ulinastatin； TREM； Alveolar macrophages； LPS

R-332；R364.5

A

1000-744X(2016)12-1249-03

2016-10-25)