李杰，陳佩玉，鄭毅，吳南屏

1型人類免疫缺陷病毒體外復制、檢測系統(tǒng)的建立及評價

李杰，陳佩玉，鄭毅，吳南屏

目的建立1型人類免疫缺陷病毒（HIV-1）體外復制和檢測系統(tǒng)（JLTRG/H9細胞混合培養(yǎng)體系），并初步應用于抗HIV-1有效藥物篩選。方法JLTRG細胞與H9細胞按不同比例混合培養(yǎng)后，通過流式細胞技術分別于24、48、72、96h觀察和檢測JLTRG細胞增強綠色熒光蛋白（EGFP）的表達來評估JLTRG細胞感染程度，并以此確定最優(yōu)感染體系。然后以此最優(yōu)體系來篩選抗HIV-1有效藥物。結果（1）在JLTRG/H9細胞混合培養(yǎng)體系中，JLTRG與H9細胞混合培養(yǎng)比例為10︰1時，JLTRG細胞EGFP表達量在各個時間點均為最高。（2）在JLTRG/ H9細胞混合培養(yǎng)體系（JLTRG與H9細胞數(shù)比值10︰1）中，T-20能有效抑制JLTRG細胞EGFP的表達，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。結論JLTRG/H9細胞混合培養(yǎng)體系（JLTRG與H9細胞數(shù)比值10︰1）適用于HIV-1藥物篩選?！娟P鍵詞】獲得性免疫缺陷綜合征；HIV-1；JLTRG細胞；H9細胞；藥物篩選檢測

在艾滋病治療方面尚無根治性的治療方法。雖然高效抗逆轉錄病毒療法（HAART）可減少艾滋病患者的機會性感染、延長生存期[1]；但病毒存在變異且可在細胞內(nèi)潛伏感染，使其不能完全清除感染者體內(nèi)的潛伏1型人類免疫缺陷病毒（HIV-1）病毒[2]。HIV-1基因易變異及其免疫逃逸的特點致使耐藥毒株的不斷增多，此外當前主流HIV-1藥物副作用亦較多，給治療帶來了嚴重的挑戰(zhàn)，新的抗HIV-1藥物開發(fā)迫在眉睫。筆者建立以JLTRG細胞基礎HIV-1體外復制、檢測系統(tǒng)，報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、儀器JLTRG細胞、H9細胞株購自ATCC（HTB-176）。流式細胞儀：BeckmanCoulterPC500MPL，美國。

1.2 實驗方法

1.2.1 HIV-1體外復制、檢測系統(tǒng)的建立JLTRG細胞和H9細胞混合培養(yǎng)，見表1，分別于24、48、72、96h吹打混勻細胞，取180l細胞混合液于流式細胞儀專用試管，加20 l40%甲醛混勻至終濃度4%，室溫靜置20min后，立即上機用流式細胞儀檢測。

1.2.2 HIV-1體外復制、檢測系統(tǒng)的評價（1）JLTRG、H9細胞的T-20藥物毒性試驗。取收集好的細胞以PBS緩沖液洗滌2次，1 000 r/min，5 min離心，棄上清，以無血清培養(yǎng)基重懸，輕輕吹打成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1.0×104/ml JLTRG或H9細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，設置10組，分別為空白對照組、T-20濃度分別為7.8 nmol/L組、1.56 nmol/L組、3.12 nmol/L組、6.25 nmol/L組、1.25 nmol/L組、2.5 nmol/L組、5.00 nmol/L組、1.00 nmol/L組和2.00 nmol/L組，每組設置3個復孔，每孔調(diào)整細胞體積為180 l，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，取出培養(yǎng)板，每孔細胞中加入20l胎牛血清放回CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。作用96 h后，分別每孔加入MTT工作液20 l，放回CO2培養(yǎng)箱中作用4h，取出96孔板，以3000r/min，15 min離心，小心棄去上清，每孔加入DMSO 200 l，震蕩，使底部藍紫色甲臜沉淀充分溶解。在酶標儀570 nm波長處讀取吸光度值（A）。以空白對照組為100%。實驗重復3次。（2）JLTRG細胞和H9細胞混合培養(yǎng)（JLTRG與H9細胞濃度比10︰1），設立T-20不同濃度梯度藥物組和對照組，見表2，分別于24、48、72、96 h流式細胞術檢測。

2 結果

2.1 HIV-1體外復制、檢測系統(tǒng)的流式細胞檢測結果（1）JLTRG細胞+H9細胞上清孔：96 h內(nèi)JLTRG細胞EGFP表達量無明顯改變。（2）JLTRG細胞孔（陰性對照孔）：JLTRG細胞的EGFP表達量低，并且96 h內(nèi)無明顯改變。（3）JLTRG：H9細胞比例為10︰1時，24、48、72、96h的值6.05、30.52、90.72、204.10，高于JLTRG/H9為640︰1的值。（4）按細胞混合比例來觀察：JLTRG︰H9細胞比例為10︰1至640︰1，熒光顯微鏡下觀察EGFP表達逐漸下降。（5）按細胞混合培養(yǎng)時間來觀察：JLTRG、H9細胞混合培養(yǎng)，隨時間的延長，JLTRG細胞EGFP表達量增加。96 h時間點各個濃度比例細胞混合體系EGFP表達量最高。見封二彩圖6。

表1 JLTRG/H9細胞混合培養(yǎng)體系優(yōu)化試驗

2.2 HIV-1體外復制、檢測系統(tǒng)評價

2.2.1 細胞毒性試驗不同濃度T20作用于JLTRG、H9細胞測MTT的A相當，見封三彩圖1、2。

2.2.2 流式細胞檢測結果（1）第10孔中JLTRG細胞EGFP表達量于96 h內(nèi)改變不明顯。（2）陰性對照孔的EGFP表達量于96 h內(nèi)無明顯改變；陽性對照孔（JLTRG細胞數(shù)：H9細胞數(shù)為10︰1）的EGFP表達量與96 h內(nèi)逐漸增加，呈時間依賴性。（3）在該JLTRG/H9細胞混合培養(yǎng)體系中，T-20濃度≥0.064nmol/L時，與陽性對照孔相比，其余各孔JLTRG細胞EGFP表達量增幅相對較小，并且呈現(xiàn)T-20濃度依賴效應，即T-20濃度愈高，體系中JLTRG細胞的EGFP表達量增加量相對愈少。（4）在單一T-20濃度上，隨著時間延長，其內(nèi)JLTRG細胞表達的EGFP量增多，但與陽性對照孔相比，EGFP表達量增幅較小。（5）IC50波動于1.6～40 nmol/L。但T-20抗HIV-1作用與IC50區(qū)段仍然可重復。見封三彩圖3。

3 討論

抗HIV藥物大致分為逆轉錄酶抑制劑[3]、HIV蛋白酶抑制劑[4]、HIV整合酶抑制劑[5]及抑制HIV病毒的進入抑制劑[6]等，傳統(tǒng)的抗藥物以病毒復制過程中的蛋白酶和逆轉錄酶為靶點，仍存在耐藥性問題、藥物毒性強、不能根除HIV病毒等問題[7]。本研究發(fā)現(xiàn)24、48、72、96 h，JLTRG+H9上清組與對照組無明顯差別，提示HIV-1感染的JLTRG細胞并不多，H9上清感染JLTRG細胞的模式并不適合應用于抗HIV-1藥物篩選模型。因此應用混合培養(yǎng)體系以建立HIV-1體外復制檢測體系，結果顯示：（1）該體系熒光背景低，適于結果分析。（2）JLTRG：H9細胞比例為10︰1混合培養(yǎng)時，體系中JLTRG細胞感染效率最高，提示JLTRG/H9細胞混合培養(yǎng)體系最優(yōu)比值10︰1。（3）按細胞混合培養(yǎng)時間顯示：隨時間的延長，JLTRG細胞EGFP表達量增加，呈現(xiàn)時間依賴性。因此，JLTRG/ H9細胞混合培養(yǎng)體系中JLTRG細胞與H9細胞數(shù)比例定為10︰1。

表2 HIV-1體外復制系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)評價-T-20

T-20是一種HIV-1融合抑制劑，可降低感染者的病毒HIV-1 RNA水平并增加CD4+細胞數(shù)量，也可聯(lián)合其他藥物用于HIV-1感染治療[8]。它結合于HIV-1 gq41蛋白從阻止HIV-1病毒侵入宿主細胞及感染細胞間的融合而發(fā)揮效用[9]。JLTRG、H9細胞細胞毒性試驗結果顯示無細胞毒性，故T-20可用于抗HIV-1藥物驗證試驗。本研究顯示：（1）在該JLTRG/H9細胞混合培養(yǎng)體系中，T-20濃度≥0.064 nmol/L時，與陽性對照孔相比，其余各孔JLTRG細胞EGFP表達量增幅相對較小，并且呈現(xiàn)T-20濃度依賴效應，即T-20濃度愈高，體系中JLTRG細胞的EGFP表達量增加量相對愈少。這說明T-20在該體系中發(fā)揮了良好的抗HIV-1的藥效。（2）在固定T-20濃度（T-20濃度≥0.064 nmol/L），隨著時間延長，其內(nèi)受HIV-1感染的JLTRG細胞比例增加，但與陽性對照孔相比，EGFP表達量增幅較小。這可能與H9不斷增值以及其持續(xù)釋放大量的HIV-1病毒顆粒、T-20耗竭有關。（3）T-20 IC50波動于1.6～40 nmol/L，但T-20抗HIV-1作用與IC50區(qū)段仍然可重復。IC50波動可能與JLTRG、H9細胞狀態(tài)關系有關，但基本趨勢與IC50區(qū)段仍然可重復。因此，JLTRG/H9細胞混合體系具有可重復性、較穩(wěn)定、可靠，并且具有以上優(yōu)點。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.12.052

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1671-0800(2016)12-1640-03

2016-09-15

（本文編輯：孫海兒）

國家科技重大專項課題任務資助項目（2008ZX10001-006）

325001浙江省溫州，溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院（李杰、鄭毅）；臺州醫(yī)院（陳佩玉）；浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院（吳南屏）

吳南屏，Email:zhyygrxzz @163.com