■黃國(guó)欣 劉大森杜江華 李桂森 王 賽 鄭 帥

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

粗蛋白(CP)是反芻動(dòng)物的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一,主要包括瘤胃降解蛋白(RDP)和過瘤胃蛋白(NFC)。其中瘤胃降解蛋白有利于瘤胃微生物的生長(zhǎng)，而微生物為動(dòng)物提供所需蛋白質(zhì)的70%～80%[1]，同時(shí)微生物的增加也有利于飼料的消化與吸收，但是瘤胃降解蛋白過多會(huì)導(dǎo)致瘤胃氨產(chǎn)生量過高[2]，過多的氨通過肝臟的轉(zhuǎn)化生成尿氮(N)，造成了蛋白質(zhì)的浪費(fèi)甚至?xí)?dǎo)致動(dòng)物氨中毒。非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(如谷物和糖蜜)通常作為反芻動(dòng)物的高能量飼料。非結(jié)構(gòu)性碳水化合物在瘤胃的發(fā)酵過程中快速地轉(zhuǎn)化成丙酸，丙酸是糖異生作用的重要前提物質(zhì)[3]。非結(jié)構(gòu)性碳水化合物影響著瘤胃的發(fā)酵，如降低原蟲的數(shù)量、pH值和飼料的消化率，甚至?xí)绊憚?dòng)物的采食量[4]。瘤胃能氮同步釋放概念是根據(jù)瘤胃微生物的生長(zhǎng)特性，通過對(duì)日糧中能量載體物質(zhì)和含氮物質(zhì)等同步化因子的調(diào)控，使其在瘤胃的發(fā)酵降解過程中物質(zhì)形式總量和釋放速度上相互匹配，促進(jìn)微生物生長(zhǎng)和瘤胃發(fā)酵的過程[5-6]。因此NFC和RDP的比例對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響顯得尤為重要[7]。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中含有約10%～13%RDP和56%的NFC時(shí)，瘤胃中的微生物粗蛋白(MCP)含量高，然而當(dāng)NFC∶RDP的比為2∶1時(shí)，微生物粗蛋白含量最高[8]，此外，NFC與RDP適當(dāng)?shù)谋壤梢杂行У靥岣叩纳锢寐蔥9-10]。

硫(S)是反芻動(dòng)物所必需的礦物元素之一，在動(dòng)物體內(nèi)約占動(dòng)物體重的0.25%，廣泛存在于含硫氨基酸、維生素、肝素、纖維蛋白原、輔酶A及谷胱甘肽中，同時(shí)動(dòng)物的蹄爪、被毛、角等各種角質(zhì)蛋白質(zhì)中也含有。硫在反芻動(dòng)物體內(nèi)起著重要的生理作用，對(duì)提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)力具有十分重要的意義。硫能夠影響瘤胃微生物的合成[11-12]以及纖維素的消化[12]。增加硫的含量會(huì)降低甲烷的排量[13]與干物質(zhì)采食量[14]，影響瘤胃的發(fā)酵。NRC(1981)建議S與N的比為1∶10，而N的來源主要是RDP提供的，因此我們猜想NFC/RDP與硫含量之間也會(huì)有相互作用共同影響瘤胃內(nèi)環(huán)境，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究的總體目標(biāo)是在滿足動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)需要量的前提下，按照NRC營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，通過人工瘤胃體外培養(yǎng)瘤胃液的方法探究不同NFC/RDP及硫水平對(duì)瘤胃發(fā)酵內(nèi)環(huán)境、主要發(fā)酵指標(biāo)和菌體蛋白合成量的影響。從而揭示能氮同步釋放和硫之間的相互作用關(guān)系及對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

選擇3只健康無(wú)病、體重相近，且裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛用于提取瘤胃液。瘺管牛的飼料按照NRC奶牛營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，日喂兩次（07:00和19:00）先喂草料，后投精料，精粗比為45∶55，自由飲水，每日清晨清除剩料，并更換清潔飲水，清理牛舍，維持牛舍的干燥衛(wèi)生清潔。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)以短期人工瘤胃法模擬瘤胃發(fā)酵的方法進(jìn)行體外試驗(yàn)。試驗(yàn)的飼料原料采用尼龍袋法測(cè)定出原料中RDP與NFC的含量，并根據(jù)飼料原料中RDP與NFC含量的不同設(shè)計(jì)3種日糧中總的能量和蛋白相同，RDP含量相同，NFC含量不同，NFC/RDP分別為3.35、4、4.8，并向每一種日糧配方中添加硫酸鈉使3種日糧中的硫濃度分別達(dá)到0.15%、0.2%、0.25%和0.3%。形成3×4雙因素完全隨機(jī)分組試驗(yàn)，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)分組見表1。每組日糧取少量制成風(fēng)干樣，粉碎過40目篩供體外發(fā)酵試驗(yàn)使用。

1.3 體外發(fā)酵試驗(yàn)

1.3.1 瘤胃液的采集與發(fā)酵液的制備

瘤胃液采集與混合發(fā)酵液制備，晨飼前從3頭已選好的荷斯坦奶牛瘤胃中采集瘤胃液，混合均勻后，通過4層紗布過濾，裝于充滿CO2的保溫瓶中保存，在最短時(shí)間內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，39℃水浴備用。人工唾液參照隋美霞[14]方法配制，加入1%刃天青數(shù)滴為指示劑，并向配制好的人工唾液中通入CO2直至溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)闊o(wú)色即為氧氣除凈。然后按人工唾液與瘤胃液為2∶1的比例制備混合發(fā)酵液備用。

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3.2 試驗(yàn)方法和測(cè)定指標(biāo)

試驗(yàn)共分12個(gè)處理組，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)發(fā)酵瓶中加入0.6 g日糧和60 ml發(fā)酵液。發(fā)酵瓶口用橡皮塞密閉，使用三通氣閥與注射器相連。發(fā)酵瓶置于39℃水浴搖床中以40 r/min的速度振蕩。培養(yǎng)瓶分別在2、4、8、12、24 h后取出，立即用pH計(jì)測(cè)定pH值，3 500 r/min離心15 min,沉淀用于測(cè)定飼料干物質(zhì)的降解率(DMD)，取上清液-20℃冷凍保存用于測(cè)定氨態(tài)氮（NH3-N）、VFA、菌體蛋白的含量。

1.3.3 數(shù)據(jù)的測(cè)定方法

產(chǎn)氣量直接從注射器上就可讀出，采用Sartorius-PB-20型酸度計(jì)測(cè)pH值；NH3-N采用馮宗慈[15]的方法進(jìn)行測(cè)定；菌體蛋白含量參考Askar等[16]方法測(cè)定；干物質(zhì)用烘干稱重法測(cè)定，揮發(fā)性脂肪酸參照秦為琳[17]的方法采用氣相色譜柱進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003軟件初步整理，結(jié)果處理采用SAS進(jìn)行雙因素分析，方差分析和多重比較，以P＜0.05為差異顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 pH值（見表2）

由表2可知，NFC/RDP對(duì)pH值影響除2 h外均顯著(P＜0.05)，NFC/RDP為4的處理組pH值顯著高于NFC/RDP為4.8的處理組(P＜0.05)。硫水平在4 h時(shí)對(duì)pH值影響不顯著（P＞0.05），其余時(shí)間點(diǎn)影響顯著。在各時(shí)間NFC/RDP的比值和硫水平之間均存在交互作用。

2.2 產(chǎn)氣量（見表3）

表2 NFC/RDP及硫水平對(duì)瘤胃pH值的影響

表3 NFC/RDP及硫水平對(duì)產(chǎn)氣量的影響（ml）

如表3所示，不同處理組底物發(fā)酵產(chǎn)氣量隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化情況。各處理組的底物發(fā)酵的產(chǎn)氣量均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。NFC/RDP水平對(duì)產(chǎn)氣量影響顯著（P＜0.05），NFC/RDP為4的處理組各時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量均顯著高于其他兩水平（P＜0.05）。硫水平對(duì)處理的產(chǎn)氣量影響顯著（P＜0.05），硫水平為0.25%的處理組顯著高于其他處理組（P＜0.05）。除8 h外，NFC/RDP和硫水平對(duì)產(chǎn)氣量均存在交互效應(yīng)。

2.3 NH3-N（見表4）

表4 NFC/RDP及硫水平對(duì)瘤胃NH3-N的影響(mg/100 ml)

由表4可見，NFC/RDP比值在8、12 h和24 h時(shí)各處理組的NH3-N濃度影響顯著(P＜0.05)，且NFC/RDP比值為4的處理組顯著低于NFC/RDP水平為3.35的處理組。硫水平在2、4 h和8 h時(shí)對(duì)各處理組的NH3-N濃度影響不顯著（P＞0.05）；硫水平在12 h和24 h對(duì)各處理組的NH3-N濃度影響顯著(P＜0.05)，且NH3-N濃度隨著硫添加量的增加而降低。NFC/RDP和硫水平對(duì)NH3-N濃度存在交互作用。

2.4 菌體蛋白（見表5）

如表5所示，各處理組的菌體蛋白濃度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。NFC/RDP對(duì)各處理的菌體蛋白含量影響差異顯著(P＜0.05)，NFC/RDP為4的處理組MCP含量顯著高于3.35的處理組(P＜0.05)，各NFC/RDP水平的處理組MCP含量由高到低依次為4＞4.8＞3.35。硫水平對(duì)各處理組MCP含量影響差異顯著(P＜0.05)。硫水平為0.25%的處理組的MCP含量最高。NFC/RDP和硫水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)MCP濃度均不存在交互作用。

2.5 飼料干物質(zhì)降解率（見表6）

由表6可以看出，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組的DM降解率不斷增加。NFC/RDP在12 h時(shí)對(duì)DM降解率影響不顯著（P＞0.05），其他時(shí)間點(diǎn)影響均顯著(P＜0.05)。NFC/RDP水平為4時(shí)，DMD略高于其他時(shí)間點(diǎn)。不同硫水平在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)DM降解率的影響差異均為顯著(P＜0.05)。硫水平為0.25%的處理組在各時(shí)間點(diǎn)DM的降解率均高于其他各組。各時(shí)間點(diǎn)的NFC/RDP和硫水平之間存在交互作用。

2.6 NFC/RDP和硫水平對(duì)瘤胃VFA含量的影響（見表7、表8、表9）

表5 NFC/RDP及硫水平對(duì)瘤胃菌體蛋白濃度的影響(mg/100 ml)

表6 NFC/RDP及硫水平對(duì)瘤胃DM降解率的影響(%)

表7 NFC/RDP及硫水平對(duì)瘤胃乙酸的影響(mmol/l)

由表7可知，各處理組底物發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。除24 h外，NFC/RDP對(duì)各處理組乙酸含量影響顯著(P＜0.05)，NFC/RDP水平為3.35的處理組的乙酸濃度顯著高于其他兩處理組(P＜0.05)，不同硫水平之間僅在4 h時(shí)存在差異（P＞0.05），硫水平在其他時(shí)間點(diǎn)對(duì)乙酸濃度影響不顯著。NFC/RDP與硫水平在8 h時(shí)存在交互作用。

如表8所示，各處理組的丙酸濃度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在各時(shí)間點(diǎn)NFC/RDP水平丙酸濃度影響顯著，NFC/RDP水平為4.8的處理組丙酸濃度最高。硫水平對(duì)相同時(shí)間點(diǎn)的各處理組丙酸濃度影響顯著(P＜0.05)，丙酸濃度隨底物含硫量的提高而升高，但硫含量為0.3%時(shí)略有下降。除2 h外，NFC/RDP和硫水平在各時(shí)間均存在交互作用。

表8 NFC/RDP及硫水平對(duì)瘤胃丙酸的影響(mmol/l)

表9 NFC/RDP及硫水平對(duì)瘤胃丁酸的影響(mmol/l)

表9列出了不同NFC/RDP和硫水平對(duì)不同處理組的丁酸濃度動(dòng)態(tài)變化的影響。NFC/RDP水平對(duì)各處理組丁酸濃度在各時(shí)間點(diǎn)影響差異顯著(P＜0.05)，NFC/RDP水平為4.8的處理組丁酸水平顯著高于NFC/RDP水平為4的處理組(P＜0.05)，除2 h外，其他時(shí)間點(diǎn)3.35的處理組丁酸水平顯著高于NFC/RDP水平為4的處理組(P＜0.05)。硫水平對(duì)丁酸濃度影響顯著(P＜0.05)，硫水平為0.25%的處理組的丁酸濃度顯著高于其他各組(P＜0.05)。NFC/RDP水平和硫水平在各時(shí)間點(diǎn)均存在交互作用。

3 討論

pH值是瘤胃發(fā)酵的一個(gè)重要指標(biāo)。在這個(gè)試驗(yàn)中，pH值變化從6.5到6.75，適合纖維素的消化[18]。隨著NFC供給的不同，pH值的變化與Broderick[19]試驗(yàn)結(jié)果相一致；此外，pH值也隨S濃度增加而提高，但是這與Weston[20]的結(jié)果不一致，Qi[21]沒有發(fā)現(xiàn)硫濃度和pH值之間的關(guān)系。這種的結(jié)果不一致可能是由于試驗(yàn)動(dòng)物不同，導(dǎo)致動(dòng)物所提供的用于做人工瘤胃發(fā)酵的瘤胃液也不同。

NH3-N是反映了飼料氮源在瘤胃中的降解以及微生物對(duì)氮源的利用情況的重要指標(biāo)，12 h之后隨著硫濃度的增加瘤胃內(nèi)NH3-N的含量降低，這與Siebert[22]和Elliott[23]的試驗(yàn)結(jié)果一致。在NFC的水平,在8 h之后才有差異，其原因可能是，雖然各處理組NFC含量不同，但是前8 h時(shí)日糧中RDP水平和NFC均可滿足微生物的需要，然而隨著微生物的繼續(xù)發(fā)酵，雖然RDP還有剩余，但是由于各實(shí)驗(yàn)組的NFC含量的不同，致使NH3-N的利用率也不相同，各處理組之間由此出現(xiàn)差異。

瘤胃內(nèi)MCP的合成主要取決于瘤胃內(nèi)碳水化合物和N的利用效率，瘤胃微生物活性受到NFC與RDP比例的影響。當(dāng)比值為4時(shí)MCP產(chǎn)量最高這與[7]試驗(yàn)結(jié)果一致。硫?qū)w蛋白的影響也顯著，當(dāng)硫水平從0.15%到0.25%不等，MCP的含量逐漸上升[24]，但是當(dāng)硫水平提高到0.3%的濃度時(shí)菌體蛋白又有所下降，說明過量的硫抑制了瘤胃微生物的生長(zhǎng)。

瘤胃中VFA主要包括乙酸、丙酸和丁酸，是碳水化合物在瘤胃中發(fā)酵的主要產(chǎn)物。乙酸是反芻動(dòng)物合成乳脂的主要前體，丙酸則是反芻動(dòng)物重要的葡萄糖前體，因此提高乙酸在VFA中的比例可以提高奶牛的產(chǎn)奶性能，而提高丙酸含量則有利于反芻動(dòng)物的育肥。碳水化合物成為VFA的主要原因影響因素,隨著NFC的增加乙酸和丙酸的含量也隨之增加，當(dāng)硫濃度從0.15%提高到0.25%時(shí)，發(fā)現(xiàn)丙酸和丁酸濃度逐漸增加，然而乙酸濃度降低，這個(gè)結(jié)果與Zinn[25]一致。但是在硫水平為0.3%時(shí)略有下降。硫水平對(duì)乙酸的影響與張桂國(guó)的結(jié)果基本一致。

本試驗(yàn)中不同NFC/RDP水平的各處理組的產(chǎn)氣量由大到小依次為4＞4.8＞3.35，說明能氮同步化釋放對(duì)瘤胃發(fā)酵影響顯著，其中當(dāng)NFC/RDP為4時(shí)飼料的消化程度最高，但與湯少勛[26]的研究結(jié)果有差異。添加硫能顯著提高產(chǎn)氣量，但是當(dāng)硫?yàn)?.3%時(shí)對(duì)產(chǎn)氣量又有抑制作用。本試驗(yàn)中NFC/RDP水平和硫水平對(duì)各處理組的瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響變化情況與各處理組DM降解情況基本一致，與Tuah[27]的研究結(jié)果基本一致。

當(dāng)RDP相同時(shí)，本試驗(yàn)中不同NFC/RDP對(duì)DM降解率的影響顯著（12 h除外），除4 h外，其它各時(shí)間點(diǎn)NFC/RDP水平為4時(shí)DMD數(shù)值上均高于其它各處理組，這與趙永生[28]的結(jié)果有一致性。試驗(yàn)中，DM的降解率隨著硫水平的提高而增加，但當(dāng)硫含量達(dá)到0.3%時(shí)，DM的降解率出現(xiàn)顯著下降。硫水平對(duì)DM降解率的影響結(jié)果與王娜[29]和王潤(rùn)蓮等[30]研究結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

當(dāng)日糧RDP相同時(shí)，不同NFC/RDP水平對(duì)pH值、NH3-N、產(chǎn)氣量、VFA菌體蛋白、DM降解率影響顯著；NFC/RDP的比為4、硫添加量為0.25%的處理組可明顯改善瘤胃環(huán)境，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，提高飼料各成分的降解率。