鹿血亞鐵血紅素肽的純化及影響因子分析

武 軍 賈冬舒 秦鳳賢 胡鐵軍 陳 巍 長春科技學院生物食品學院 莊 紅 吉林大學軍需科技學院

以鹿血制備亞鐵血紅素肽并采用超濾法純化，由單因素實驗和三元二次回歸正交組合設計優(yōu)化得到最佳實驗方案：流速為26.5×10-3L/min，pH為7.5，溫度為20 ℃。最優(yōu)條件下得到原血中亞鐵含量為175 μg/mL。三個影響因子的重要性關系從大到小依次為溶液pH、流速、溫度。

亞鐵血紅素肽；純化；影響因子

亞鐵血紅素肽是將畜禽血液中的血紅蛋白經(jīng)物理和化學方法處理，除去大部分氨基酸，得到的長度不等的短肽段與血紅素連接而成。亞鐵血紅素肽中含有天然有機鐵類的卟啉鐵，在不同pH條件下均可溶解，如在強酸、堿性條件下的胃、小腸中都可溶解，具有營養(yǎng)特性且無高滲性。本研究以鹿血紅蛋白為原料，應用酶技術制得亞鐵血紅素肽，并采用超濾技術對其進行純化。

超濾技術是以靜壓差作為動力，對不同大小分子量（0.5～1000 kDa）的溶質(zhì)進行分離的膜技術。超濾技術可分離的物質(zhì)有蛋白質(zhì)、多糖、膠粒、病毒等。目前主要應用于醫(yī)藥、食品、廢水處理、飲用水凈化、生物產(chǎn)品加工、金屬加工涂料和石油加工等行業(yè)。鑒于超濾技術的突出優(yōu)點，本文采用超濾法純化亞鐵血紅素肽。

1 材料與方法

1.1 材料

鹿血：長春世鹿鹿業(yè)集團有限公司提供；中性蛋白酶、風味酶：廣西南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器設備

ZD-2型自動電位滴定儀；V-255型分光光度計；3 kDa和10 kDa微孔濾膜；CR20B2高速冷凍離心機。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶解產(chǎn)物的制備

提供的方法進行前處理。采用中性蛋白酶和風味酶復合水解鹿血紅蛋白溶液酶解，立即水浴升溫至90 ℃，保持15 min，滅酶。將酶解產(chǎn)物在離心機中以9000 r/min離心10 min，將酶解產(chǎn)物先通過10 kDa濾膜進行超濾，再經(jīng)3 kDa的超濾膜超濾，兩次超濾過程可起到濃縮亞鐵血紅素肽的作用，將濾液冷凍干燥，即得亞鐵血紅素肽成品。用原子吸收法測定超濾后透析液中亞鐵的含量。

1.3.2 影響亞鐵血紅素肽超濾純化因子的研究

1.3.2.1 流速

將經(jīng)過兩次酶解的酶解液在90 ℃水浴中滅酶15 min，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.5，在不同流速下進行超濾實驗，將超濾后的透析液用原子吸收法測定亞鐵含量，換算成原血中亞鐵含量，以原血中亞鐵含量為實驗指標進行觀察。

1.3.2.2 pH

將超濾流速調(diào)到最優(yōu)值，將酶解液調(diào)至不同的pH值進行實驗，用原子吸收法測定，以原血中亞鐵含量為實驗指標進行評價。

1.3.2.3 溫度

將流速、溶液pH均調(diào)整至最佳值，將酶解液放在不同溫度的水浴鍋中進行實驗，評價指標同上。

1.3.3 超濾最佳工藝參數(shù)的研究

本實驗采用流速、pH、溫度三個因素為工藝參數(shù)，研究亞鐵血紅素肽的最佳純化方案。然后采用三元二次回歸組合設計實驗方法優(yōu)選亞鐵血紅素肽超濾純化的最佳技術參數(shù)。選定流 速（z1）、pH（z2）、 溫 度（z3）三個試驗因素，并取m0=3。由p=3，r=3，可查得r2=1.831或r=1.353，因素水平及其編碼見表1。

1.3.4 測定方法

1.3.4.1 鐵標準曲線的繪制

用分移液管分別吸取1、2、3、4 mL和5mL的硫酸亞鐵銨標準溶液于100 mL容量瓶中，用蒸餾水配成100 mL的溶液。它們的濃度分別為1、2、3、4 μg/mL和5 μg/mL，以溶液的濃度為橫坐標，以鐵的吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.4.2 亞鐵含量的測定

準確稱取5 mL的樣品，置于100mL燒杯中，加入10mL濃鹽酸攪拌至樣品完全溶解，將處理好的樣品倒入150 mL分液漏斗中，分別加入5 mL 1∶1硫酸，10 mL 20%硫氰酸鉀，混勻后加入30 mL無水乙醚，振搖，待溶液分層后提取下層由三價鐵形成的硫氰酸鐵溶液，反復數(shù)次，直至乙醚層無色，除去乙醚層。余下的轉(zhuǎn)入容量瓶中，通過火焰原子吸收法測定鐵的含量。

2 結果與分析

2.1 亞鐵血紅素肽超濾純化影響因子的研究

2.1.1 超濾流速對亞鐵含量的影響

鹿血酶解液在90 ℃水浴中滅酶15 min，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.5，在不同流速下進行超濾實驗，將超濾后的透析液用原子吸收法測定，以原血中亞鐵含量為實驗指標。結果如圖1所示。

在壓力恒定的情況下，通過超濾膜表面的料液流速越大，滯留在膜表面的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)越容易脫離膜表面的吸附，減緩濃差極化現(xiàn)象及凝膠層的形成，使膜通量增加，減輕膜污染的程度。由圖1可以看出，當流速升高時，亞鐵的含量也升高。超濾流速在（13.3～26.7）×10-3L/min內(nèi)，亞鐵的含量與流速呈正相關；當流速超出此范圍后，亞鐵的含量開始下降，這可能是當超濾壓力超過最優(yōu)壓力時，出現(xiàn)濃差極化現(xiàn)象，使膜通量下降，超濾膜發(fā)生堵塞，因此亞鐵的含量也下降。

表1 自然因素水平及其編碼表

圖1 流速對亞鐵含量的影響

圖2 pH對亞鐵含量的影響

2.1.2 溶液pH值對亞鐵含量的影響

將超濾流速調(diào)到最優(yōu)值，將酶解液調(diào)至不同的pH值進行實驗，其它實驗條件不變。結果如圖2所示。

由圖2可以看出，在pH值小于7.5時，亞鐵含量和pH的變化呈現(xiàn)正相關，當pH值至7.5時，亞鐵含量達到最大值，之后隨著pH上升，亞鐵含量開始下降。這可能是由于pH大于7.5時，體系中的電荷分布及蛋白的電性發(fā)生改變，導致超濾膜與溶液的排斥力減弱，濃差極化現(xiàn)象加重。

表2 三元二次回歸組合設計試驗數(shù)據(jù)分析表

2.1.3 溫度對亞鐵含量的影響

將流速、溶液pH均調(diào)整至最佳值，將酶解液放在不同溫度的水浴鍋中進行實驗。結果如圖3所示。

由圖3可以看出，實驗開始時，隨著溫度的上升，亞鐵的含量也不斷上升，當溫度升至20 ℃時，亞鐵含量最高，之后隨著溫度的升高，亞鐵含量呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于溫度升高，料液的粘度逐漸下降，溶液擴散系數(shù)增大，亞鐵的含量逐漸升高。而當溫度超過20 ℃后，膜孔的曲折率提高，透過液在膜中的實際通過距離增大，過膜的阻力增加，膜通量減小，且蛋白發(fā)生易發(fā)生結構改變，二價鐵逐漸氧化為三價鐵，因此亞鐵的含量下降。

圖3 溫度對亞鐵含量的影響

2.2 超濾最佳工藝參數(shù)的研究

采用三元二次回歸正交組合設計對實驗方案進行優(yōu)化，結果見表2。

3 結論

以鹿血制備的亞鐵血紅素肽采用超濾法純化，分析流速、溶液pH、溫度等對純化過程的影響，進行單因素實驗及三元二次回歸正交組合設計實驗優(yōu)化最佳的亞鐵血紅素肽純化方案，流速的最優(yōu)值為26.5×10-3L/min，pH的最優(yōu)值為7.5，溫度的最優(yōu)值為20℃。最優(yōu)條件下得到原血中亞鐵含量為175 μg/mL。三個影響因子的重要性關系從大到小依次為z2、z1、z3，即溶液pH、流速、溫度。

長春市重大科技攻關計劃，鹿血活性多肽微膠囊制備及產(chǎn)業(yè)化關鍵技術（編號：14KG070）。

武軍（1964-），女，副教授。研究方向：食品科學肉產(chǎn)品。