同時測定保健食品中煙酸、煙酰胺、咖啡因、維生素B1和維生素B6檢測方法

李 明 劉向前 張玉華 麗江市食品藥品檢驗所

在現(xiàn)有標準GB/T 5009.197-2003的基礎(chǔ)上，優(yōu)化一種合理、快速的基于高效液相色譜分離，能同時測定煙酸、煙酰胺、咖啡因、維生素B1和維生素B65種成份的方法。探討流動相、色譜柱、檢測波長、穩(wěn)定性等對上述5種成份分離的影響。結(jié)果顯示，該方法標準曲線線性非常好，R大于0.999 99，RSD為1.1%～1.5%，樣品加標回收率為98.5%～103.2%。可用于煙酸、煙酰胺、咖啡因、維生素B1和維生素B65種成份的同時檢測，本法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、快捷高效等特點。

食品；煙酸；煙酰胺；咖啡因；維生素B1；維生素B6；高效液相色譜法

現(xiàn)代生活中，煙酸、煙酰胺、咖啡因、維生素B1（鹽酸硫胺素）和維生素B6（鹽酸吡哆醇）已成為人們補充維生素類產(chǎn)品中必不可少的東西，它們具有協(xié)同作用，調(diào)節(jié)新陳代謝，維持皮膚和肌肉的健康，增進免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)功能，促進細胞生長和分裂（包括促進紅血球的產(chǎn)生，預(yù)防貧血發(fā)生）。隨著人們保健意識不斷提高，市場上含以上5種成份的品種繁多，如何控制好5種成份的含量已成為目前的關(guān)注點，含量過高或過低都對身體無好處，為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，有必要建立簡單、快速、高效的檢測方法，目前測定以上5種成份的標準是GB/T 5009.197-2003，此標準中流動相、色譜柱、檢測波長等方面均存在一定的問題，導致樣品的回收率偏低、出具的數(shù)據(jù)也不準確，無法滿足目前的測定需求，筆者在實際操作中經(jīng)反復(fù)實驗，對此方法進行改進，實驗結(jié)果較滿意。

1 儀器與試劑

Agilent 1200液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器，美國；LabTech EV311旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，北京萊伯科技有限公司；賽多利斯BT224S電子天平，德國。

甲 醇、 乙 腈（HPLC級，F(xiàn)isher scientific）、辛烷磺酸鈉（B8）為色譜純，磷酸為分析純，煙酸對照品，煙酰胺對照品，咖啡因?qū)φ掌?，維生素B1對照品，維生素B6對照品。

實驗室用水均為銳思捷（ELGA）超純水系統(tǒng)制備的超純水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax-C18，3.5 μm，150 mm×4.6 mm； 流 速：1.0 mL/ min；柱溫：35 ℃；進樣量：10μL；檢測波長：煙酸、煙酰胺、咖啡因、維生素B1260 nm，維生素B6280 nm；流動相：溶劑A，0.1%的B8水溶液+磷酸，500 mL+0.5 mL；溶劑B，乙腈；提取液：甲醇-水-磷酸（100 mL+400 mL+0.5 mL）。

雙波長條件和梯度條件見表1、表2。

表1 雙波長條件

表2 梯度條件

2.2 標準溶液的配置

2.2.1 標準貯備液的配制

標準儲備液A：準確稱量已扣除水分的煙酸、煙酰胺和咖啡因?qū)φ掌?6 mg于10 mL容量瓶中，加提取液稀釋并定容至刻度。再精密量取1 mL于20 mL容量瓶中，用提取液稀釋并定容至刻度。

標準儲備液B：準確稱量已扣除水分的維生素B610 mg于10 mL容量瓶中，加提取液稀釋并定容至刻度。再精密量取1 mL于20 mL容量瓶中，用提取液稀釋并定容至刻度。

標準儲備液C：準確稱量已扣除水分的維生素B623.2 mg于100 mL容量瓶中，用提取液定容，再精密量取1 mL于20 mL容量瓶中，用提取液稀釋并定容至刻度。

2.2.2 標準曲線

精密量取上述標準貯備液A、B、C，1.0、2.0、4.0、6.0mL和8.0mL分別置20 mL的容量瓶中，用提取液稀釋并定容至刻度，搖勻備用。

2.3 樣品前處理

精密稱取樣品（千林B族維生素片）1.00 g于10 mL容量瓶中，加提取液定容，超聲提取5 min后，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后待進樣。

3 結(jié)果與討論

3.1 流動相的選擇

GB/T 5009.197-2003采用兩種離子對試劑（硫酸月桂酸酯鈉和1-葵烷磺酸鈉），分兩次測定維生素B1和其余4種物質(zhì)，兩種試劑價格較貴，用量少，市場不易購得，且5種物質(zhì)用兩套流動相分兩次完成測定，不夠方便快捷[1]。

已有文獻報道同時測定功能性食用品中B族維生素的方法，如特殊鍵合色譜柱[2]，緩沖鹽體系在C+柱上測定[3]，離子色譜對試劑和C18柱，反向離子對色譜法同時測定維生素B1和B6等[4-6]。三聚氰胺測定中用到色譜級B8，各實驗室易得。本方法選用疏水鏈長度與癸烷磺酸鈉接近的B8作為離子對試劑，經(jīng)優(yōu)化條件，得到滿意的結(jié)果，且色譜柱在試驗前后未見性能下降跡象[1]。

與國家標準方法相比，B8離子對試劑便宜易得，流動相系統(tǒng)簡單，一次分析即可完成測定，且單次分析時間大大縮短，國家標準方法需做兩次，分別為20 min和55 min，本文方法只需單次15 min。

3.2 色譜柱的選擇

通過用粒徑5 μm的C18柱和3.5 μm的C18柱，按上述色譜條件分別試驗，如圖1所示，粒徑為3.5 μm的C18柱分析結(jié)果更佳，因此選擇用粒徑3.5 μm的C18柱進行分析。

3.3 檢測波長的選擇

分別對5種測定成分進行紫外吸收光譜分析，根據(jù)定量時應(yīng)盡可能選擇最大波長進行測定的原則，本文方法選擇鹽酸硫胺素、咖啡因、煙酸、煙酰胺的波長為260 nm，鹽酸吡哆醇的波長為280 nm。

3.4 線性范圍和檢出限

用國家標準方法對混合標準溶液系列和樣品溶液，按照所述的色譜條件進行測定，如圖3、5所示，以所得峰面積對質(zhì)量濃度進行回歸，得到煙酸、煙酰胺、咖啡因、維生素B1和維生素B65種成份的線性回歸方程，見表2。結(jié)果表明，5種成份在0.58～32.4 μg/mL內(nèi)，按國家標準方法得到的線性關(guān)系一般，相關(guān)系數(shù)R大于0.992，煙酸、煙酰胺、咖啡因、維生素B1和維生素B65種成份的檢出限為0.01～0.15 μg/mL，定量限為0.030～0.451 μg/mL；按本文方法對混合標準溶液系列和樣品溶液進行測定，如圖4、6所示，得到的線性關(guān)系非常好，相關(guān)系數(shù)R大于0.999 99 ，煙酸、煙酰胺、咖啡因、維生素B1和維生素B65種成份的檢出限為0.000 47～0.005 20 μg/mL，定量限為0.001 41～0.01 56 μg/mL。

3.5 回收率與精密度

在本文色譜分離條件下，對已經(jīng)過預(yù)先處理的食品進行分析測定，實驗結(jié)果見表3和表4。

圖1 5 μm柱的優(yōu)化結(jié)果

圖2 3.5 μm柱的優(yōu)化結(jié)果

圖3 按本文方法得到的標準溶液色譜圖

圖4 按國家標準方法得到的樣品色譜圖

圖5 按本方法得到的樣品色譜圖

表3 5種方法按本文方法得到的線性關(guān)系及檢出限

表4 樣品按本文方法得到的測定結(jié)果和回收率

4 結(jié)論

針對食品中煙酸、煙酰胺、咖啡因、維生素B1和維生素B65種成份的定量檢測，采用本文經(jīng)過反復(fù)驗證后的新方法，得到靈敏度高、重現(xiàn)性好、快捷高效的結(jié)果。

[1]鄭春巍,劉洋,王啟輝,等.反向離子對色譜法同時測定多維礦物質(zhì)膠囊中維生素B1、B6、煙酸、煙酰胺和咖啡因[J]分析儀器,2011(3):17-20.

[2]李少旦,彭衛(wèi)芳.反相高效液相色譜法同時測定維生素B6、煙酰胺和泛酸鈣[J]. 理化檢驗:化學分冊,2009(7):800-802.

[3]郝榮輝,夏敏,谷學新.反相高效液相色譜法同時測定動物營養(yǎng)液中B族維生素[J].現(xiàn)代科學儀器,2006(6):81-83.

[4]高 旭,李 淑 娟,安 娟,等.高效液相色譜法同時測定食品中8種水溶性維生素[J].中國醫(yī)藥指南,2008(19):36-38.

[5]杜小光.反相高效液相色譜法分離測定復(fù)合維生素片劑中VB1,VB2,VB6和煙酰胺[J].分析實驗室,2006(3):86-88.

[6]海彩虹,董錦燕,盛愛軍.高效液相色譜法測定六維膠丸中維生素B1、維生素B2、煙酰胺含量[J].上海醫(yī)藥,2006(10):474-476.