陳志則 夏中元 孟慶濤

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，湖北 武漢 430060)

·實驗研究·

百里醌通過抑制JAK2/STAT3信號通路減輕肝缺血再灌注損傷的研究

陳志則△夏中元 孟慶濤

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，湖北 武漢 430060)

目的 探討百里醌對肝缺血再灌注損傷的影響及其機制。方法 建立小鼠肝缺血再灌注損傷模型。30只C57小鼠隨機分為三組,每組10只,分別為假手術(shù)組、缺血/再灌注損傷組和百里醌預(yù)處理組。各實驗組肝缺血90 min再灌注4h時采血和收集肝臟標本, ELISA法分別檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、炎癥因子白介素-6 (IL-6)、白介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α (TNF-α)水平。Western blottin檢測肝組織中JAK2、 STAT3、p- JAK2和 p-STAT3的表達。RT-PCR 檢測肝臟TNF-α、IL-6 和IL-1β的表達及HE染色肝組織的病理改變。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，缺血/再灌注損傷組ALT、 AST、 p-JAK2、p-STAT3、 TNF-α、IL-6 和IL-1β的表達和病理改變明顯增加，而JAK2和STAT3的表達無明顯改變。與缺血/再灌注損傷組相比，百里醌預(yù)處理組ALT、 AST、 p-JAK2、p-STAT3、TNF-α、IL-6 和IL-1β的表達和病理改變明顯減少，而JAK2和STAT3的表達依然無明顯改變。結(jié)論 百里醌能減輕肝缺血再灌注損傷，其機制可能是通過抑制JAK2/STAT3信號通路減輕炎癥。

百里醌； 肝缺血再灌注損傷； 炎癥; JAK2/STAT3信號通路

肝缺血再灌注損傷是臨床上常見的危重癥，常繼發(fā)于休克、肝移植、肝臟切除等。 其發(fā)病機制復(fù)雜，具體機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥、凋亡和壞死在肝缺血再灌注損傷中起重要作用[1-2]。百里醌(thymoquinone)是從Nigella sativa植物中提取的一種物質(zhì),長期用于治療哮喘、濕疹、痢疾、頭痛等。最近研究發(fā)現(xiàn)百里醌具有多種生物學(xué)作用，如抗炎、抗凋亡、抗腫瘤等[3-4]。 而炎癥是臨床危重癥肝缺血再灌注損傷的重要發(fā)病機制[5-7]。本研究利用小鼠構(gòu)建缺血再灌注損傷模型，探討百里醌對肝缺血再灌注損傷的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和耗材

百里醌 (哈森：上海),無水乙醇 (Sigma：美國)，3%戊巴比妥鈉(橋星，上海), HE試劑由湖北省人民醫(yī)院病理實驗室配制。β-actin抗體(Abmart，中國)；JAK2(CST, USA), p- JAK2(CST, USA) ，p-STAT3(CST, USA)， STAT3(CST, USA),β-actin (abgent，USA)；顯微鏡(Olympus BX51)及成像系統(tǒng)(HITMAS-30)均由醫(yī)院病理科實驗室臨床病理組提供。百里醌用無水乙醇溶劑并配制成濃度為1 mol/L的貯存液，-20 ℃冰箱保存。

1.2 動物與造模

30 只雄性C57小鼠，體質(zhì)量20～25 g，SPF 級, 購自武漢大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于湖北省人民醫(yī)院實驗動物實驗中心,設(shè)施使用證明號:014098。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,狀態(tài)良好, 隨機分為假手術(shù)(Sham)組、肝臟缺血再灌注損傷(IRI)組和百里醌預(yù)處理(thymoquinone)組,每組10只。thymoquinone組術(shù)前給予百里醌 (50 mL/kg)腹腔注射,劑量參照文獻[6]；Sham 組和IRI 組術(shù)前給予等濃度生理鹽水腹腔注射;Sham組給予假手術(shù),IRI 組和Thymoquinone組給予肝臟缺血再灌注手術(shù)。肝臟缺血再灌注手術(shù)方式如下:戊巴比妥鈉麻醉狀態(tài)下,腹正中切口開腹，分離暴露肝門部, 剪斷左中肝葉各韌帶, 游離左中肝葉的膽管及門靜脈、肝動脈分支 。用無創(chuàng)傷血管夾夾閉肝左外葉、肝中葉之門靜脈及肝動脈分支,致70%肝臟缺血[8]。阻斷后可見被血供阻斷區(qū)肝葉顏色由鮮紅色變?yōu)榘导t色提示肝臟缺血成功 ,缺血 90 min 后松夾再灌4 h 形成肝缺血再灌注模型。假手術(shù)組操作同上，但不夾閉血管。再灌注4 h后處死小鼠,收集血清和肝臟標本。實驗中動物狀態(tài)較好,蘇醒較快,無死亡，術(shù)后給予正常飲食飲水。

1.3 血清中ALT、 AST、IL-6、 TNF-α 和 IL-1β水平檢測

按照ELISA試劑盒說明書操作步驟，檢測血清中ALT、 AST、IL-6、TNF-α 和 IL-1β的表達水平。

1.4 肝臟病理檢測

肝臟組織采用10% 多聚甲醛固定,常規(guī)脫水浸蠟(Thermo Fisher),石蠟包埋,4 μm切片,脫蠟透明后由病理科實驗室HE染色。病理評分：0分為沒有損傷；1分為輕微損傷，胞漿空泡變性和局灶性細胞核固縮；2分為中度至重度損傷，具有廣泛的核固縮；3分為組織炎癥、出血和中性粒細胞浸潤及解體嚴重壞死。

1.5 Western印跡檢測

取肝臟組織于精微天平稱重，按照每50 mg組織中加入1 mL RIPA裂解液(以1∶50加入50×cocktail)，冰上勻漿，裂解30 min后，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min后取上清，BCA法測定蛋白濃度。以含50μg蛋白質(zhì)的上樣量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳(5 %濃縮膠，10%分離膠，恒壓80～100 V)后轉(zhuǎn)膜(PVDF膜,恒流300 mA)，然后洗膜，以5%脫脂奶粉(TBST配制)封閉1 h，JAK (1∶2000)、 p-JAK2 (1∶1000)、STAT3(1∶1000)、 p-STAT3(1∶500)、β-actin(1∶3000)單抗孵育過夜，再次振洗后加入羊抗兔IgG-HRP(二抗)37 ℃孵育1 h。洗膜后加ECL試劑，Kodak化學(xué)發(fā)光儀曝光顯示目的蛋白并拍照。以Quantity one對條帶進行定量分析，以目的條帶和β-actin條帶積分灰度值比值為結(jié)果。

1.6 IL-6、TNF-α 和 IL-1β檢測

稱取適量肝臟組織，于液氮中研磨成粉末狀提取總RNA，紫外分光光度計測量濃度，逆轉(zhuǎn)錄及擴增反應(yīng)按試劑盒說明書進行。以管家基因β-actin作為內(nèi)參對照基因，用得到的各樣本的Ct值按公式2-ΔΔCT計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 為實時定量PCR檢測的引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 ALT和AST水平比較

與Sham組相比，IRI組 ALT和AST值明顯升高[ALT和AST值分別為(160±12)、(76±11)U/L，而Sham組為(13±2)、(7±3)U/L，P< 0.05 ]。thymoquinone組與IRI組相比，ALT和AST值明顯降低[ALT和AST值分別為(90±10)、(30±10)U/L，(P< 0.05)]。提示百里醌預(yù)處理可以明顯減輕肝臟缺血再灌注損傷。見圖1。

圖1 百里醌對肝臟缺血再灌注損傷ALT和AST值的影響

2.2 肝臟病理改變

Sham組肝細胞形態(tài)正常, 肝血竇區(qū)無充血、腫脹，未見炎癥細胞浸潤，其損傷評分為(1±0.5)；IRI組肝小葉結(jié)構(gòu)大量破壞，肝細胞廣泛聚集、壞死，肝血竇區(qū)明顯充血腫脹，門管區(qū)有大量炎性細胞浸潤，其損傷評分為(8±2)分(P<0.05)；而thymoquinone組肝小葉破壞，肝細胞聚集、壞死，肝血竇區(qū)充血腫脹， 門管區(qū)炎性細胞浸潤均較IRI組明顯減少，其損傷評分為(4±1)分(P<0.05)。見圖2。

圖2 百里醌對肝臟病理改變的影響

2.3 促炎癥細胞因子IL-6、TNF-α 和 IL-1β表達的比較

結(jié)果顯示，IRI組促炎癥細胞因子IL-6、TNF-α 和 IL-1β水平明顯增加(P<0.05)，而thymoquinone組IL-6、TNF-α 和 IL-1β水平較IRI組明顯降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 百里醌對促炎癥細胞因子TNF-α (A,D)、IL-6 (B,E) 和 IL-1β(C, F)表達的影響

2.4 p-JAK2和p-STAT3、JAK2和STAT3表達的比較

與Sham組相比，IRI組p-JAK2和p-STAT3表達明顯上調(diào)(P<0.05)，而JAK2和STAT3表達無明顯差異(P>0.05)。thymoquinone組與IRI組相比，p-JAK2和p-STAT3表達明顯下調(diào)(P<0.05), 而JAK2和STAT3表達無明顯差異(P>0.05)。提示百里醌預(yù)處理可減輕JAK2/STAT3信號通路的激活。見圖4。

圖4 百里醌對JAK2、 p-JAK2、 p-STAT3和STAT3表達的影響

3 討 論

肝臟缺血再灌注損傷是肝臟血供中斷后，重新恢復(fù)血流灌注導(dǎo)致?lián)p傷反而進一步加重的肝臟損傷，常見于移植、外傷、肝臟切除手術(shù)等，涉及一系列復(fù)雜炎癥級聯(lián)反應(yīng)。肝臟血供中斷后導(dǎo)致ATP缺乏，會引發(fā)炎癥反應(yīng)?；謴?fù)肝臟血流灌流可導(dǎo)致炎癥信號通路的進一步大量激活，誘發(fā)大量肝臟細胞進一步凋亡、壞死，從而進一步加劇肝臟損傷。由于肝臟缺血導(dǎo)致的直接損傷和再灌注誘發(fā)的繼發(fā)性損傷均涉及大量炎癥信號通路的激活，因此抑制炎癥是減輕肝臟缺血再灌注損傷的有效途徑。

本實驗結(jié)果顯示，與IRI組相比，thymoquinone組肝臟失功、肝小葉破壞、肝細胞聚集壞死、肝血竇區(qū)充血腫脹、門管區(qū)炎性細胞浸潤程度均明顯減輕。這提示百里醌預(yù)處理可以明顯減輕肝臟缺血再灌注損傷和肝臟病理改變。進而發(fā)現(xiàn)百里醌能下調(diào)促炎癥細胞因子IL-6、TNF-α 和 IL-1β的表達，提示百里醌可通過抑制炎癥減輕肝臟缺血再灌注損傷。但百里醌抑制炎癥的具體機制不明。最近研究發(fā)現(xiàn)JAK2/STAT3介導(dǎo)炎癥在肝臟缺血中扮演重要角色[8-10]，而百里醌可調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號通路[11-12]。本實驗結(jié)果顯示，百里醌對JAK2和STAT3的表達無明顯影響，但可抑制JAK2和STAT3的激活通過磷酸化修飾，與IRI組相比，thymoquinone組p-JAK2和p-STAT3的表達明顯降低，這顯示百里醌可通過抑制JAK2/STAT3信號途徑的激活來減輕炎癥，進而減輕肝臟缺血再灌注損傷。

綜上所述，我們推測百里醌可通過抑制JAK2/STAT3信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來發(fā)揮保護肝臟缺血再灌注損傷的作用。但除了抑制JAK2/STAT3信號通路外，是否還存在其它途徑減輕肝缺血，尚需進一步研究。

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武漢市科技攻關(guān)項目[2013062301010818]

R-332

A

1000-744X(2016)02-0156-04

2015-05-28)

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