袁磊 吳雨崗 王勍 王海濤 錢光陽

(常州市第一人民醫(yī)院蘇州大學(xué)附屬第三學(xué)院胃腸外科，江蘇 常州 213000)

Th17細胞相關(guān)細胞因子在結(jié)直腸癌患者體內(nèi)的分布及臨床意義

袁磊 吳雨崗△王勍 王海濤 錢光陽

(常州市第一人民醫(yī)院蘇州大學(xué)附屬第三學(xué)院胃腸外科，江蘇 常州 213000)

目的 探討結(jié)直腸癌(CRC)患者體內(nèi)Th17細胞相關(guān)細胞因子IL-17A、IL-17F、IL-23的表達情況及其臨床意義。方法 選擇30例CRC患者和15名健康者為對照，采用實時熒光定量PCR法檢測腫瘤組織和正常瘤旁組織中細胞因子IL-17A、IL-17F、IL-23 mRNA表達水平，ELISA法檢測外周血IL-17A、IL-23的水平；并作臨床相關(guān)性分析。結(jié)果 腫瘤組織標(biāo)本中IL-17A的mRNA、IL-23的mRNA相對表達量高于對照組瘤旁組織中的mRNA相對表達量，差異皆有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；IL-17F的 mRNA相對表達量低于對照組中的mRNA相對表達量，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；外周血IL-17、 IL-23水平均高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。它們與患者的性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤發(fā)生部位均無關(guān)(P>0.05),而與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 CRC 患者體內(nèi)存在著細胞因子IL-17A、IL-23的高表達，提示Th17細胞可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。

結(jié)直腸癌； Th17細胞； IL-17; IL-23

結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma, CRC)是全球范圍內(nèi)困擾人類的常見惡性腫瘤之一，占腫瘤導(dǎo)致患者死亡人數(shù)的第三位[1]；尤其是在中國這樣的發(fā)展中的人口大國，CRC的患病率和死亡率一直高居不下,極大地摧殘著患者的生理和心理健康。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的重要因素是感染和慢性炎性反應(yīng)，其中炎性反應(yīng)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及疾病的進程密切相關(guān)[2]。輔助性17細胞(Thl7)是新近發(fā)現(xiàn)的與自身免疫疾病、腫瘤、炎性反應(yīng)和移植排斥反應(yīng)相關(guān)的細胞群, Thl7細胞分泌的白細胞介素17(IL-17)和白細胞介素23(IL-23)等炎性細胞因子介導(dǎo)了上述過程的發(fā)展[3]。本研究通過檢測CRC患者腫瘤組織中和正常瘤旁組織Th17相關(guān)細胞因子IL-17A、 IL-17F和IL-23表達情況以及比較外周血中細胞因子IL-17、IL-23表達水平，分析它們與臨床各項指標(biāo)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

標(biāo)本來源于2012年10月至2013年4月常州市第一人民醫(yī)院就診的30例CRC癌患者,其中直腸腺癌18例，結(jié)腸腺癌12例；男性21例，女性9例；平均年齡(65±3.20)歲。實驗組相關(guān)組織標(biāo)本均取自手術(shù)，所有病例均經(jīng)病理診斷證實。其中，腫瘤浸潤深度在黏膜及黏膜下層3例，固有肌層6例，漿膜及漿膜外21例；并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例；遠處轉(zhuǎn)移6例。根據(jù)美國腫瘤聯(lián)合會(AJCC)大腸癌2010年pTNM分期標(biāo)準(zhǔn)進行分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期8例，Ⅲ期12例，Ⅳ期6例，并分為早期組(Ⅰ期、Ⅱ期)和進展期組(Ⅲ、Ⅳ期)。對照組組織標(biāo)本均為距腫瘤邊緣>10 cm且病理診斷驗證無腫瘤浸潤的正常瘤旁組織。術(shù)前l(fā) d清晨空腹抽取上述患者外周靜脈血3 mL；另收集15名健康者外周血標(biāo)本作為對照。所有研究對象均無類風(fēng)濕、紅斑狼瘡、慢性潰瘍性結(jié)腸炎等自身免疫性疾病史, 無免疫治療史, CRC患者術(shù)前均未接受過任何其它治療。

1.2 主要試劑

TRIzol○R試劑(Invitrogen by Life Technologies)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(A3500，Promega Corporation)，實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ，Perfect Real Time，Takara Bio，Inc.)；人IL-17 ELISA試劑盒(R&D Systems，Inc．) ，人IL-23 ELISA試劑盒(R&D Systems，Inc．) 。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR法檢測細胞因子IL-17A、 IL-17F和IL-23的mRNA表達水平 -70℃保存的CRC組織、正常瘤旁組織樣本稱取100 mg，在預(yù)冷的研缽中以液氮充分研磨組織，加入l mL Trizol溶液在玻璃勻漿器中徹底勻漿，室溫靜置30 min。將勻漿液移至1．5 mL 離心管中，室溫靜置5 min，按12 000 rpm，4 ℃離心5 min后吸取上清，提取總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR green 染料法進行實時定量PCR 擴增目的基因。PCR 引物(由上海生工生物工程公司設(shè)計并合成)序列，IL-17A：正向引物5’-TTG ATT GGA AGA AAC AAC GAT GA-3’以及反向引物5’-CTC CAG GCT CAG CAG CAG TAg-3’；IL-17F：正向引物5’-GCC GCT CCA CCT CCCC-3’以及反向引物5’-AGA TGT CTT CCT TTC CTT GAG CA-3’；IL-23：正向引物 5’-GTG AGA TGT CAA GAA ACA GGC AAA-3’以及反向引物5’-AGT AAG GTG CCC TGT AGA GAT GGA-3’。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃15 s；40 個循環(huán)，每個循環(huán)95 ℃ 5 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s。對PCR 產(chǎn)物熒光值以2△△CT方法計算目的基因mRNA相對表達量。

1.3.2 ELISA法檢測外周血中細胞因子IL-17、IL-23水平 將所抽取的外周血標(biāo)本按3 000 rpm離心10 min后吸取上清于-80℃保存待測，用雙抗夾心法分別檢測血清中細胞因子IL-17、IL-23水平。操作過程按ELISA試劑盒說明進行，細胞因子濃度用pg/mL表示。

2 結(jié) 果

2.1 兩組標(biāo)本中細胞因子IL-17A、 IL-17F和IL-23的mRNA表達水平

實時熒光定量PCR 法檢測結(jié)果見表1。實驗組標(biāo)本中IL-17A的mRNA相對表達量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.042)；IL-17F的 mRNA相對表達量低于對照組，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.538)；IL-23的mRNA相對表達量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.047)。

表1 兩組標(biāo)本中Th17細胞相關(guān)細胞因子IL-17A、 IL-17F和IL-23的mRNA表達水平

2.2 外周血標(biāo)本細胞因子IL-17、IL-23的表達水平

ELISA法檢測外周血中細胞因子IL-17、IL-23水平的結(jié)果見表2。實驗組血清IL-17水平高于健康對照組(P=0.032)，IL-23水平高于對照組瘤旁組織培養(yǎng)液上清中的IL-23水平，兩組差異皆有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.008)。

表2 ELISA法檢測外周血IL-17、IL-23的水平

2.3 CRC患者體內(nèi)Th17相關(guān)細胞因子和各項臨床資料指標(biāo)的關(guān)系

收集CRC患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤發(fā)生部位，有無淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期等相關(guān)臨床資料，分別分析上述兩種方法檢測的腫瘤組織中Th17細胞相關(guān)細胞因子表達水平與各項臨床資料的關(guān)系，結(jié)果顯示腫瘤組織中及血清標(biāo)本中Th17相關(guān)細胞因子表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤發(fā)生部位均無關(guān)(P>0.05),而與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)(P<0.05),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者其腫瘤組織及血清中IL-17A、 IL-17F和IL-23表達水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，且進展期腫瘤組織及血清中細胞因子表達水平高于早期腫瘤組織。見表3、表4。

表3 腫瘤組織中細胞因子IL-17A、 IL-17F和IL-23的mRNA相對表達量與臨床各指標(biāo)關(guān)系

表4 外周血IL-17、IL-23表達水平和臨床各指標(biāo)關(guān)系

3 討 論

CRC是大腸粘膜上皮在不良飲食因素、炎癥刺激或遺傳等多種致癌因素作用下發(fā)生的惡性病變，從最初的低度不典型增生腺瘤發(fā)展到高等級不典型增生腺瘤并最終轉(zhuǎn)化成癌，這個過程伴隨著腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因突變積累和分子變化[4-5]。越來越多的證據(jù)表明， CD4+T細胞不同的淋巴細胞亞群之間的平衡和它們的細胞因子網(wǎng)絡(luò)是CRC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[6-7]，而其中尤以新近發(fā)現(xiàn)的Th17細胞備受矚目。Th17細胞同樣由初始T細胞分化而來，具有獨立的不同于Th1型和Th2型CD4+T細胞的分化及發(fā)育機制[8]，在許多自身免疫性疾病和慢性炎癥疾病中發(fā)揮重要免疫調(diào)節(jié)作用；而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，Th17細胞參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9-10]。

Th17細胞以表達IL-17而得名，這種新發(fā)現(xiàn)的促炎癥細胞因子包括6個家族成員—IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D(即IL-27)和IL-17E(即IL-25)、IL-17F[11]。Th17 細胞分泌的細胞因子IL-17及相關(guān)細胞因子，通過介導(dǎo)炎癥細胞從而發(fā)生炎性反應(yīng)，而 IL-17A和IL-17F可以誘導(dǎo)表達多種趨化因子、促炎因子。IL-17的表達和多種自身免疫性疾病相關(guān)，其分化發(fā)育過程中受到了轉(zhuǎn)化生長因子-B(transforming growth factor beta，TGF-β)和IL-6以及IL-23、IL-21等細胞因子的調(diào)節(jié)[12]。IL-23同樣是一種十分重要的炎性介質(zhì)，甚至被認為是腸道炎性反應(yīng)的始動者，能引起炎性細胞因子級聯(lián)反應(yīng)，致使腸道中IL-17、IL-6、IL-22表達水平增高，從而加劇炎性反應(yīng)[13]；IL-23在Thl7細胞最初的分化過程中并不起作用，它作用于已經(jīng)分化好的Thl7細胞，在維持Th17細胞的效應(yīng)方面發(fā)揮重要作用，對促進Thl7細胞的存活與擴增是必須的[14]。雖然一致認為Th17細胞在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著較為關(guān)鍵的作用，但其所起的作用及機制仍然存在很大爭議[15]。在CRC初發(fā)階段，Th17 細胞在腫瘤患者體內(nèi)可能發(fā)揮促炎性反應(yīng)的作用，起到了一定的抗瘤作用，但隨著腫瘤的進一步發(fā)生發(fā)展，患者機體免疫系統(tǒng)逐步失衡，相關(guān)炎性反應(yīng)逐漸加劇，失控的炎性反應(yīng)通過IL-6 活化細胞轉(zhuǎn)錄因子(如Star3)等途徑促進Th17 細胞的增殖分化和細胞因子IL-17、IL-23的分泌，它們繼而上調(diào)抗凋亡、促生長和促血管生成基因的表達，從而發(fā)揮了促瘤的作用[16-18]。

為了探討Th17細胞相關(guān)細胞因子在CRC患者外周血和腫瘤組織中的分布情況以及可能所起的作用，作者通過實時熒光定量PCR法檢測CRC患者腫瘤組織中與正常瘤旁組織中IL-17A、 IL-17F和IL-23的mRNA表達水平，結(jié)果顯示腫瘤組織中IL-17A和IL-23的mRNA水平均高于正常瘤旁組織，而IL-17F的mRNA水平在兩種組織中無差異，這一結(jié)果在細胞因子水平上表明，CRC患者腫瘤組織有利于Th17細胞維持活性效應(yīng)和擴增，且有IL-17A的表達水平增高。同時，我們對它們和各項臨床資料指標(biāo)的關(guān)系進行了分析，結(jié)果顯示Th17細胞相關(guān)細胞因子IL-17A和IL-23表達水平與腫瘤患者的性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤發(fā)生部位無關(guān)，而與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)，暗示Th17細胞參與了CRC的免疫病理過程，而高濃度的IL-17A、 IL-23與CRC的預(yù)后密切相關(guān)。為了更進一步比較并驗證Th17細胞相關(guān)細胞因子在CRC患者體內(nèi)相關(guān)組織的分布，本研究比較了CRC患者與健康對照組外周血IL-17和IL-23的表達水平。關(guān)于Th17細胞相關(guān)細胞因子在CRC患者外周血中升高早有報道，本資料中IL-17、IL-23的表達情況與Stanilov等的報道相一致，CRC患者血清中IL-17、IL-23水平明顯高于健康對照，并推測患者外周血細胞因子水平升高是由于腫瘤組織產(chǎn)生釋放入血而致。我們同樣分析了CRC患者外周血中IL-17、IL-23表達水平與各項臨床指標(biāo)的關(guān)系，顯示IL-17、IL-23表達水平同樣只與CRC患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)。

綜上所述，CRC患者腫瘤組織及外周血存在著IL-17、IL-23的高表達，提示腫瘤組織確實存在著利于Th17細胞活化擴增和維持效應(yīng)的因素，其表達的相關(guān)細胞因子在CRC的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。因此，可以將它們作為重要的生物指標(biāo)用于CRC的診斷與預(yù)后；而干預(yù)Th17細胞分泌相關(guān)細胞因子可能成為治療CRC的新策略。

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Distribution and clinical significance of Th17 cell-associa ted cytokines in colorectal cancer patient

YuanLei,WuYugang△,WangQing,WangHaitao,QianGuangyang.

DepartmentofGastrointestinalSurgery,TheThirdAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,TheFirstPeople'sHospitalofChangzhou,Changzhou213000,China.

Objective To explore the expression and clinical significance of Th17-related cytokines IL-17A, IL-17F, IL-23 in colorectal cancer patient (CRC). Methods A group of 50 patients and 15 healthy controls were included in the study. Real-time quantitative PCR was used to detect the expression levels of IL-17A, IL-17F, IL-23 and the quantitative determination of IL-23, IL-17 serum levels were performed by ELISA. The potential associations between them with the clinicopathological characteristics were analyzed. Results The IL-17A mRNA and IL-23 mRNA expression of tumor tissue samples were(0.02218±0.00549)and(0.00232±0.00478), significantly higher than those of healthy control (P<0.05)．The levels of serum IL-17 and IL-23 of CRC patients were significantly higher than those of the controls (16.39±1.72 vs 7.91±4.74 pg/ml, 68.12±11.22 vs 9.13±6.65 pg/ml (P< 0.05). The increased expression of IL-17A mRNA and IL-23 mRNA, also the levels of the serum IL-17 and IL-23 were not associated with the gender and age of patients with CRC, nor the umor size , tumor site (P>0.05), but associated with the lymph node metastasis and TNM stage (P< 0.05). Conclusion There was a significant increase of Th17 cell-associated cytokines in colorectal cancer patients, which suggests that IL-17 and IL-23 may directly or indirectly contribute to the development and progression of CRC.

Colorectal cancer； Th17； IL-17； IL-23

常州市科技支撐計劃基金資助項目[CE20125020]

R735.3

A

1000-744X(2016)02-0135-04

2015-12-04)

△通信作者,Email：wuyugang89@163.com